9.1.4 原代培养常用方法
原代细胞往往由多种细胞组成，比较混杂，即使从形态上为同一类型（上皮样或成纤维样），但细胞间仍有很大差异。如果供体不同，即使组织类型、部位相同，个体差异也照样存在，原代细胞生物特性尚不稳定，如需做较为严格的对比实验研究，还需进行短期培养。
1）组织块培养法
组织块培养是常用、简便易行和成功率较高的原代培养方法，也是早期采用培养细胞的方法，曾被称为组织培养。
将剪成的小组织团块接种于培养瓶（或皿）中，瓶壁可预先涂以胶原薄层，以利于组织块粘着于瓶壁，使周边细胞能沿瓶壁向外生长，方法简便，利于培养，部分种类的组织细胞在小块贴壁24 h后细胞就从组织块四周游出，然后逐渐延伸，长成肉眼可以观察到的生长晕，5～7天后组织块中央的组织细胞逐渐坏死脱落和发生漂浮，此漂浮小块可随换液而弃去，由组织块周围延伸的贴壁细胞也逐渐形成层片，可在显微镜下观察形态和用于实验研究。其具体操作方法如图9.3所示。
图9.3 组织块原代培养操作示意图
①按照前述方法取材，将组织剪成或切成1 mm3左右的小块，并加入少许培养基使组织湿润。
②将小块均匀涂布于瓶壁，每小块间距0.2～0.5 cm，一般在25 mL培养瓶（底面积为17.5 cm2）接种20～30小块为宜，放置完成后轻轻翻转培养瓶，使瓶底朝上，然后于瓶内加入适量培养基盖好瓶塞，将瓶倾斜放置在37℃培养箱内培养。(https://www.daowen.com)
③培养2～4 h待小块贴附后，将培养瓶缓慢翻转平放，静置培养，动作要轻，切忌摇动和振荡，以防引起小块漂起而造成培养失败。若组织块不易贴壁可预先在瓶壁涂一薄层血清。开始培养时培养基不宜多，以保持组织块湿润即可，培养24 h后再补液，培养初期移动和观察时要轻拿轻放，开始几天尽量不要搬动，以利于贴壁和生长，培养3～5天后可换液，一方面补充营养，另一方面除去代谢产物和漂浮小块所产生的毒性作用。
2）单层细胞培养法
单层细胞培养是将分离得到的细胞根据实验要求用培养液配制成所需浓度的细胞悬液，接种到培养瓶（皿）内，水平放置进行培养。每隔1～2天更换培养液一次。细胞可在瓶（皿）底壁贴壁生长，培养一段时间后可形成一细胞单层。
单层细胞培养方法更换新鲜培养液比较容易。例如，先用含血清培养液培养，然后可以方便地更换为无血清培养液培养，用于观察某些因子加到培养液后所起的作用，以及从培养液中减去某些因子后对细胞生长的影响；如果实验要求细胞密度较高时，较容易采用灌注技术提供高密度细胞所需要的营养成分；另外，当细胞粘附在基质上后，更容易表达某些产物；而且单层细胞培养适用于许多细胞系。
3）悬浮细胞培养法
悬浮细胞培养是指细胞悬浮在培养液中生长增殖的培养方式。如淋巴细胞、骨髓细胞和许多肿瘤细胞（包括杂交瘤细胞）以及某些转化细胞等非贴壁依赖性的动物细胞都可悬浮在培养液中生长。细胞悬液的制备方法如图9.4所示。
图9.4 细胞悬液制备示意图