9.5.3 玻璃化冻存方法
玻璃化冻存法对动物细胞、皮肤和角膜等组织，尤其对胚胎等有良好的效果。下面以人单核细胞为例介绍动物细胞的玻璃化冻存方法。
1）冻存过程
①用常规方法分离全血中的单核细胞。
②在冰浴中预冷冻存液：Hanks中加20.5%DMSO（质量浓度）、16.6%乙酰胺（质量浓度）、10%丙二醇（质量浓度）和10%聚乙二醇（相对分子质量8 000），用2 mol／L NaOH调pH为7.4，现配现用。
③将装有单核细胞的离心管放入冰浴中。
④沿离心管壁缓缓滴加预冷的冻存液。滴加过程：前3 min以0.3 mL／min速度滴加；后5 min以0.6 mL／min速度滴加；余下的冻存液以0.75 mL／min速度滴加，边滴加边轻轻晃动离心管。2×107个细胞要滴加15 mL冻存液，滴加的时间约为15 min，最终细胞密度要在1×106～1.5×106个／mL。滴加速度要慢，以保证让保护剂有足够的时间缓慢地渗入细胞内，达到细胞内外的平衡。
⑤轻轻吹吸混匀细胞冷冻悬液。将该悬液分装于冻存管中。(https://www.daowen.com)
⑥将冻存管用火焰封口。最后将冻存管直接放入液氮中保存。
2）玻璃化冻存细胞的复苏
①将冻存管从液氮中取出，立即放入冰浴中5 min。
②将冻存管两端剪断，将5 mL细胞冻存悬液移至50 mL离心管内。
③沿离心管壁缓慢加入在冰浴中预冷的含20%胎牛血清的Hanks液。前10 min以0.2 mL／min速度加入；后10min以0.5 mL／min速度加入；接着15 min以0.75 mL／min速度加入；最后30min以1mL／min速度加入。全过程为65min，都在冰浴中进行。将稀释后的细胞悬液以400 r／min离心5 min，弃上清液。
④向细胞沉淀中加入培养液重新悬浮细胞，用于培养。
以上复苏时冻存液的稀释和弃除过程与冻存前冻存液的滴加一样，必须在4℃冰浴中进行，以避免在室温下冷冻保护剂对细胞产生毒性。稀释过程也要缓慢进行，以保证有足够时间让保护剂从细胞内渗出胞外，从而达到细胞内外的平衡，避免引起渗透损伤。
