实训7　小鼠胚胎成纤维细胞的原代培养

实训7　小鼠胚胎成纤维细胞的原代培养

【实训目的】

1.掌握小鼠成纤维细胞原代培养的方法和步骤。

2.熟悉培养细胞的观察方法。

3.了解体外培养成纤维细胞的基本形态。

【实训原理】

细胞培养分原代培养和传代培养。原代培养是由体内取出组织，经消化酶（常用胰蛋白酶和胶原酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，将其分散成单细胞，置于合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖。原代培养细胞离体时间短，遗传性状和体内细胞相似，适于做细胞形态、功能和分化等研究。原代培养细胞移动性较强，细胞分裂不旺盛，存在异质性细胞。

所有组织中都有一定量的细胞间质（纤维和基质等），对细胞生长有妨碍作用，用胰蛋白酶消化能去除间质，使组织松散成单个细胞或小细胞团，易于细胞生长。

【试剂与主要用品】

1.仪器用具：超净工作台、二氧化碳培养箱、水平吊桶离心机、倒置相差显微镜、实体解剖显微镜、水浴锅（37℃）、无菌培养皿、移液枪、无菌吸头、无菌15 mL离心管、眼科剪刀、眼科镊、废液缸、计时器、血细胞计数板、记号笔、妊娠13～15天孕鼠。

2.试剂：DMEM高糖培养基、新生牛血清、200 mmol／L谷氨酰胺、100×双抗浓储液、0.25%胰蛋白酶、75%乙醇、PBS缓冲液。

【操作步骤】

具体操作步骤如下：(https://www.daowen.com)

①紫外线照射细胞培养室和超净工作台至少30min灭菌。进入细胞培养室之前，洗净双手并用75%乙醇消毒，换上消毒衣帽鞋。

②配制生长培养基：在50 mL离心管中配制40 mL完全生长培养基，添加10%新生牛血清、谷氨酰胺（终浓度为2 mmol／L）、青霉素和链霉素（终浓度为100 U／mL和100μg／mL）。

③取孕鼠颈椎脱臼法处死，在细胞培养室外，用75%乙醇浸没1～3 min。

④从消毒乙醇中取出孕鼠，移入细胞培养室操作台上，腹面朝上放于无菌培养皿上，解开皮肤层、肌肉层，打开腹腔，将连接在子宫上的组织及脂肪剪去，取出子宫，放入一个新的含冷PBS的培养皿中，移至超净工作台。

⑤用剪刀打开子宫壁，取出胚胎，将胚胎外的胞膜小心去除，进一步去除胎头和各种内脏。

⑥将胚胎再移入一个新的培养皿中，用PBS洗3次，去除PBS，用弯头虹膜剪将胚胎剪成1～3 mm2大小组织块，加入PBS清洗至溶液基本无色。

⑦将组织块再移入一个新的培养皿中，加入PBS，静置1min左右，待组织块沉降下来后，吸去PBS。加入0.25%胰蛋白酶溶液，体积约为组织块的2倍，室温下消化5～10 min，期间用移液器轻轻吹打2次，会在倒置显微镜下发现大量细胞释放出来。

⑧加入等体积的含血清的培养基终止消化，用移液器轻轻吹打5～10次，使更多单细胞释放出来。将上部溶液转入15 mL离心管中静置数分钟，将上清移到一个新离心管中，弃掉剩余组织块。

⑨800～1 000 r／min离心收集有细胞悬液的离心管5 min，去除上清，加入培养液1～2 mL（视细胞量），血细胞计数板计数。

⑩将细胞调整到56×105个／mL左右，转移至新的培养瓶中，加入3～5mL完全培养基，转入二氧化碳培养箱中培养。

【结果与讨论】

每日在倒置显微镜下观察细胞生长状况。