一、病原学
（一）结核杆菌
结核杆菌包括结核分枝杆菌和牛分枝杆菌，是分枝杆菌菌属内对人类（及动物）治病的主要病原菌。其中以结核分枝杆菌发生率最高，约占90%以上；其次为牛分枝杆菌，约5%。
1 形态
结核杆菌正常、典型的形态是直或微弯曲细长杆菌。大小为（0.3～0.6）μm×（1～4）μm，单个散在，有时呈“V”、“Y”形或条索状、短链状排列。Ziehl-Nielsen染色抗酸性强。牛分枝杆菌比结核分枝杆菌短而粗，在不同条件下形态不尽相同，呈现多形性。组织培养结核杆菌较痰内或人工培养液上为长且更弯曲，明显呈条索状排列。抗酸性是分枝杆菌属的一个显著特征，借以与大多数其他杆菌区分的一个显著标志是革兰染色阳性但不易着色。
2 培养特性
结核杆菌是专性需氧菌，空气内加5%～10%CO2刺激生长，在35～40 ℃范围内均可生长，最适宜生长温度为37 ℃。在固体培养基上，结核杆菌增殖时间为18～20小时。在液体培养基内为14～15小时。因此，结核杆菌生长很缓慢，培养时间需8天以上，甚至长达8周。
3 生化特性
结核杆菌生物活性低，结核分枝杆菌与牛分枝杆菌均为不发酵糖类。触酶活性很弱，68 ℃加热后丧失，借此可与非结核分枝杆菌鉴别。Tween-80水解试验阴性，耐热磷酸酶试验阴性，尿素酶试验阳性。结核分枝杆菌硝酸盐还原性强，烟酸试验阳性，烟酰胺酶试验阳性，而牛分枝杆菌均为阴性。
4 抗原构造
分枝杆菌细胞的结构十分复杂，它含有许多结合成大分子复合物的不同蛋白质、糖类和脂类。在许多情况下，一个单分子内存在着一个抗原决定簇。所以，一个单一的蛋白质分子具有多种特异性和共同的抗原决定簇。Joniski等用电泳证实结核分枝杆菌有11种主要抗原。抗原1、抗原2和抗原3是多糖类，经鉴定为阿拉伯甘露聚糖、阿拉伯半乳聚糖和大分子的葡聚糖，这些抗原是所有分枝杆菌共有的。抗原6、抗原7和抗原8也是共有的。抗原5是结核分枝杆菌具有抗原特性的糖蛋白。Seisest从结核分枝杆菌培养液中精制出蛋白质A、B、C、PPD，及PPDS，进一步证明结核菌素是蛋白质成分。克洛斯（Closs）等以交叉免疫电泳研究BCG浓缩培养物滤液的抗原成分，计数有31条清晰、稳定的沉淀物，其中有许多抗原可被其他分枝杆菌抗血清所吸附，说明是分枝杆菌共同性抗原。因此，抗原分析和纯化技术是结核杆菌抗原结构研究的重要课题。
5 结核分枝杆菌基因组与致病机制
随着人类基因组测序计划的进行以及人类基因组图谱的公开，模式生物基因组测序的对象也相继开展起来。1998年英国Sanger中心和法国Pasteur研究所科学家合作完成了结核分枝杆菌H37RV株的全部基因组测序工作，这为结核病病原菌致病基因的研究提供了极好的机会。结核分枝杆菌全基因组序列由4.41 Mb组成，包括4411个基因，具有潜在编码能力的基因有3 977个，约占90.2%；有3924个开放阅读框，其中约40%有功能，44%可能有功能，16%称为孤儿序列，与其他微生物的序列无相似性。基因组富含GC碱基，G+C含量高达65.6%。重复DNA序列度高，可能与结核分枝杆菌的DNA修复机制非常忠实有关。在2个蛋白质家族中，富含甘氨酸重复结构，功能未知，可能是产生抗原变异、逃避宿主免疫的主要来源。结核分枝杆菌序列测定前确定的毒力因子仅3个：①过氧化物酶，其功能是抵抗宿主巨噬细胞产生的活性氧；②mce编码巨噬细胞集落因子，刺激巨噬细胞聚集；③SigmaA因子，其突变将导致减毒。序列测定后发现了一些新的毒力因子。目前已知有关的结核分枝杆菌毒力相关基因有：①分泌重复蛋白，与细菌在宿主内繁殖有关；②溶血素，具有溶血活性；③Virs蛋白质，与细菌入侵、存活有关；④过氧化物酶，与细菌在细胞内存活有关；⑤Sigma因子家族，调控细菌在细胞内存活状况。
近年来，引起结核分枝杆菌持续感染的基因成为研究重点。研究发现，结核分枝杆菌的异枸橼酸裂解酶基因是使细菌持续存活的关键基因。该基因的产物Icl在细菌利用脂肪酸作为碳源的代谢中十分重要。当结核分枝杆菌感染机体时，免疫系统参与，感染则由急性转入持续感染，结核分枝杆菌则转为利用脂肪酸作为碳源这一代谢旁路。将去除Icl基因的变异体结核分枝杆菌感染小鼠，则不能引起持续感染。另一与细菌持续感染相关的基因为pcaA，编码环丙烷合成酶，是形成α-分枝盐酸的关键。α-分枝盐酸是分枝杆菌酸末端形成碳环的结构，是覆盖分枝杆菌细胞表面的组分。同样，将去除pcaA基因的菌株感染小鼠，在前两周与野毒株一样引起感染，但以后细菌数下降，并且pcaA酶的抑制剂可在持续期杀死细菌。由于上述基因存在，结核分枝杆菌在不同环境均可生存，形成持续感染。
6 结核分枝杆菌的诊断技术
（1）涂片镜检：痰涂片镜检操作简单，仍是发现和诊断肺结核最经典、最有效的手段。其中，荧光显微镜镜检较一般显微镜镜检具有较高的灵敏度，尤其对于含菌量少的病例。但在肺外结核患者，痰涂片镜检的阳性率往往很低。
（2）BACTEC检测技术：传统的结核分枝杆菌培养技术耗时、费力，BACTEC检测技术使结核分枝杆菌快速培养成为可能，而且已具备进行分离培养、菌种鉴定和药敏试验能力，明显缩短报告时间。在BACTEC460-TB检测系统中，将检验标本接种于含有14C-棕榈酸的7H12B培养基内，37 ℃培养。该系统自动检测分枝杆菌分解14C-棕榈酸产生14CO2的含量，并换算成生长指数，并对其进行分析、报告。新一代的BACTE c mgI960全自动分枝杆菌快速生长培养仪与BACTEC460-TB仪相比，无放射性核素污染，解决了环境污染问题。
（3）分子生物学检测技术。
1）DNA探针技术：DNA探针是能识别特异性核苷酸的带标记的一小段DNA分子。DNA探针技术的主要方法是分子杂交，其原理是在适当的温度、离子强度和pH条件下，DNA探针与DNA或RNA的互补碱基通过氢键紧密结合在一起，形成稳定的DNA∶DNA或DNA∶RNA复合物，经放射自显影、酶联免疫检测、发光自显影或荧光检测显示结果。分枝杆菌DNA探针的主要类型有：cDNA探针、全染色体DNA探针、克隆DNA探针和寡核苷酸探针等。核酸探针杂交技术在结核分枝杆菌的分子生物学研究、细菌分类和鉴定、流行病学调查等方面具有十分重要的作用。但核酸探针杂交技术也存在一定缺陷，如检测的灵敏度不够理想、只能鉴定少数几种分枝杆菌等，故将特异性强的核酸探针与敏感性高的核酸体外扩增技术相结合，已成为结核病诊断研究和防治的趋势。
2）PCR技术：即聚合酶链反应，是一种根据DNA复制原理而设计的体外DNA或RNA扩增方法，由高温变性、低温退火及适温延伸等反应组成一个周期，循环畸形，使DNA得以迅速扩增。因此，PCR扩增的原理决定其具有高度的敏感性。随着多种PCR扩增仪的出现，从而使PCR技术具有灵敏、快速、简便、特异及自动化操作等特点。试验证明，PCR能够检测出在试管中难以生长的少量的分枝杆菌，甚至死菌释放的未降解的DNA，故对培养阴性的结核患者早期诊断、鉴别诊断及化疗后排菌情况的观察很有帮助。但在临床应用中，由于诸多原因而存在着严重的假阳性和假阴性现象，不宜作为常规的检测方法。
3）DNA指纹图谱：也称“核酸指印技术”，其基本原理是用限制性内切酶消化结核分枝杆菌染色体DNA上特定的核苷酸序列，在琼脂糖凝胶中电泳分离后，将限制性片段转移至膜上，与带标记的已知DNA探针杂交，检测出与探针同源的限制性片段，这些片段数目和大小的变化是每株分离株呈现特征性带型，即指纹图谱型。结核分枝杆菌DNA指纹图谱的遗传标志有插入序列IS6110、IS1081、DR序列、PGRS、MPTR等。此技术主要应用于结核病的流行病学研究，在追踪传染源特别是耐多药菌株的传染源，及时查明和迅速阻止传播方面，有一定的流行病学意义。但由于试验条件限制等因素，影响了核酸指印技术应用于临床。
4）DNA序列测定技术：DNA序列测定是进行基因机构、基因表达和基因调控等核酸研究的一项关键技术。其基本原理是建立在变性聚丙烯酰胺凝胶电泳技术的基础上，变性聚丙烯酰胺凝胶具有很高的分辨率，差别1个碱基的单链寡聚核苷酸也能被分离，故将待测DNA片段变成一系列放射性标记的单链寡核苷酸，使一端为一固定的末端。在4种不同双脱氧核苷的反应体系中，寡核苷酸产物分别终止于不同位置的A、T、G或C碱基，将其上取样于变性聚丙烯酰胺凝胶中相邻的孔道电泳分离，放射自显影后从4种末端寡聚核苷酸梯子形图谱中，就可读出DNA的核苷酸序列。常用的DNA序列测定方法有双脱氧链终止法，此法简便，快速；其次有化学降解法，此法准确率高，重复性好。但上述两种方法模板需要量大，模板制备繁琐且费时。随着PCR技术的广泛应用，PCR技术和DNA测序技术相结合产生了PCR测序新方法，通过PCR制备DNA测序模板简便、快速；具体方法有PCR-双脱氧链终止法、PCR-循环测序法等。目前，DNA序列测定技术已应用于结核分枝杆菌的耐药基因型鉴定和结核分枝杆菌菌种鉴定。(https://www.daowen.com)
5）DNA芯片技术：即基因芯片技术，其基本原理是将多种探针固定在玻璃等基片上，与待测样本的DNA或RNA进行杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号强度而获取样品分子的数量和序列信息。高密度基因芯片只用单一杂交步骤，迅速、敏感地完成大量标本序列的测定，检测基因表达，以及染色体DNA序列多态性与单核苷酸多态性定位检测，并对小片缺失和插入进行分析。该技术具有无可比拟的高效、快速和多参量的特点，使得同时分析数以千计的DNA序列成为可能，是传统生物技术的一次重大创新和突破。目前，DNA芯片技术在结核分枝杆菌菌种鉴定、耐药性研究、基因组比较分析研究等方面均有应用。如同时将结核分枝杆菌DNA的保守片段和耐药基因固定在芯片上，即可在诊断结核分枝杆菌的同时对其耐药性做出诊断，以利于指导用药。
6）免疫学检测：结核病的快速、准确诊断，是防治结核病的重要措施之一。结核病诊断的金标准仍然是临床检查结合细菌培养和痰涂片直接镜检。但众所周知，上述方法是无法发现早期的亚临床感染。目前，许多学者努力从结核分枝杆菌中分离和鉴定出特异性抗原用作诊断试剂，以提高诊断的敏感性和特异性。
7）全血y-干扰素检测试验：结核菌素或纯蛋白衍生物皮肤试验检测细胞介导的免疫应答，已被应用多年，并得到广泛承认。然而，卡介苗接种使PPD试验很难对结核分枝杆菌感染作出诊断。因为PPD是将结核分枝杆菌培养物加热灭活和沉淀制成的一组含许多不同变性节段的蛋白质，为成分不明确的复合抗原，而且所包含的抗原为致病性分枝杆菌，环境分枝杆菌及BCG所共有，故PPD试验特异性差，不能明确区分BCG免疫、环境分枝杆菌感染、致病性分枝杆菌感染。PPD试验需要在48～72小时内观察结果，可能导致很高的释放率。而全血IFN-r检测方法很有可能成为替代传统的结核菌素皮肤试验的结核病临床辅助诊断方法。
IFN-r主要由活化的T淋巴细胞及自然杀伤细胞产生。分泌IFN-r的CD4+T细胞在小鼠及人类抗结核感染中的重要作用早已被证实。然而，一些研究表明，CD8+T细胞也能分泌IFN-r，而且CD8+T细胞的细胞毒活性及其所分泌的IFN-r在抗结核感染中也发挥重要作用。因此，检测受结核分枝杆菌特异性抗原刺激所产生的IFN-r水平，对于了解宿主对结核分枝杆菌感染产生免疫应答的状态，以及建立临床辅助诊断方法具有指导意义。
目前，PPD已用于分枝杆菌抗原致敏的特异性IFN-r分泌淋巴细胞的体外检测，即全血直接法，用PPD刺激淋巴细胞24小时，随后用酶联免疫吸附试验检测产生的IFN-r。全血检测方法有许多优点，如仅需非常少量的血液标本，快速而间断，并且T细胞应答情况保持了与在活体内相似的状态，但全血试验的弱点仍在于缺乏特异性抗原。
8）结核分枝杆菌特异性抗原试验：近年从结核分枝杆菌培养滤液中鉴定出一种低分子抗原ESAT-6。通过对鼠结核病模型的研究发现，ESAT-6基因是人型结核分枝杆菌所特有的，在所有BCG和绝大部分环境分枝杆菌中都缺失。因此，ESAT-6主要存在于致病性结核分枝杆菌而不在非结核分枝杆菌。结核患者分泌IFN-r的淋巴细胞能够识别ESAT-6抗原，ESAT-6在结核患者中诱发的免疫应答反应远比其他分枝杆菌蛋白强烈。在结核病低发国家的研究表明，结核患者对ESAT-6的应答率为60%～80%，而在健康人中没有出现应答。ESAT-6中含有多个T淋巴细胞表位，故ESAT-6试验可能在不同人群中诱发应答，因为只有结核分枝杆菌感染者的T细胞能识别ESAT-6。所以ESAT-6是区别结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌的最佳候选抗原。
另一个高度特异性抗原是CFP-10，是在克隆了结核分枝杆菌ESAT-6基因的启动子区域后发现的，与ESAT-6有相同菌种分布，即仅分布于各型结核分枝杆菌中，出现在结核患者中。但BCG没有该类分子，也不出现在接种BCG的健康人群中。
据此，特异性抗原免疫试验能够检测患者的免疫系统是否被结核菌致敏，不需要在痰、胃液或活检标本检出结核菌就可以确诊疾病。该试验在临床快速确诊或排除结核病中十分重要。除了临床应用外，新型特异性抗原诊断试验在大量流行病学调查中也很有用，它可以迅速评估高危人群中的结核病状况。其主要优点为在患者出现明显症状之前就可以进行诊断，因此可以减少疾病的传播。
（二）非结核分枝杆菌
非结核分枝杆菌包括除结核分枝杆菌和麻风分枝杆菌以外的分枝杆菌菌属，其中部分是致病菌或条件致病菌。近年来非结核分枝杆菌感染呈上升趋势，引起人们广泛关注。
1 非结核分枝杆菌的分类
自1885年最早从临床标本中分离出耻垢分枝杆菌以来，迄今已发现近百种，历来对此命名甚多，常用的是NTM，又称MOTT。1993年黄山会议将NTM正式命名为“非结核分枝杆菌”。此后人们对NTM的组织学与诊断标准进行深入的探讨。根据产色、生长速度和细胞化学反应等主要特征将NTM分为4群：RunyonⅠ群（光产色群）；RunyonⅡ群（暗产色群）；RunyonⅢ群（不产色群）；RunyonⅣ群（快速生长群）。根据NTM对人和动物的致病性以及生物学特征的相似性，又提出了NTM复合菌群分类，包括：①鸟-胞内分枝杆菌复合群MAIC或MAC，有鸟分枝杆菌、胞内分枝杆菌、瘰疬分枝杆菌和副结核分枝杆菌等，为最常见的条件性致病菌。②戈登分枝杆菌复合群，包括戈登分枝杆菌、亚洲分枝杆菌、苏尔加分枝杆菌，多属暗产色菌。③堪萨斯分枝杆菌复合群，目前有堪萨斯分枝杆菌和胃分枝杆菌。④地分枝杆菌复合群，有地分枝杆菌、不产色分枝杆菌和次要分枝杆菌。⑤偶然分枝杆菌复合群。普雷海姆（Preheim）按Runyon分类将非结核分枝杆菌病和病因学的种名做了更简明的分门别类，使NTM的研究更加深入。
2 NTM的来源及传播途径、易感人群
NTM广泛存在于自然界，大部分是腐物寄生菌，主要见于水、土壤和气溶胶。NTM的疏水特性形成的生物膜使其可持续生存于供水系统中。某些NTM如MAC、蟾蜍分枝杆菌、偶然分枝杆菌、龟分枝杆菌对消毒药及重金属的耐药性使其生存于饮水系统中。调查研究证明，自来水、经处理的透析用自来水和作为诸如甲紫溶液等用的蒸馏水，是院内感染的病原菌来源。蟾蜍分枝杆菌是一种嗜热菌，是在管道供热水中唯一被发现的NTM。商售蒸馏水中偶然有分枝杆菌和龟分枝杆菌可以繁殖。快速增长的NTM医院感染主要源于医用物品和器械污染。
目前普遍认为人们可从周围环境中感染NTM而患病，水和土壤是重要的传播途径。NTM引起的人体疾病常为继发性的，患者大多有慢性基础疾病或免疫损害。在艾滋病和免疫受损宿主中，NTM病通常表现为易播散性。NTM皮肤和骨骼病变多发生于创伤后或使用皮质类固醇的患者。与结核分枝杆菌比较，NTM毒力和致病性均较低，通常属于机会性致病菌。NTM对现有抗结核药物大多耐药，感染后易成为慢性病或难治性病例。NTM是艾滋病的主要机会感染菌，HIV/AIDS流行与一些机会分枝杆菌相联系，由于该菌广泛的环境分布很难预防，艾滋病晚期最易感染鸟分枝杆菌，增加了AIDS的治疗难度和病死率。
3 分枝杆菌属的分类鉴定
分枝杆菌的菌种鉴定结果，多通过观察细菌生长及生化反应获得。采集患者的痰、支气管肺泡灌洗液、创面渗出物、脓液、淋巴结穿刺液、脑脊液、血液或骨髓抽出物等作为标本。细菌培养是将标本接种于罗氏培养基与对硝基苯甲酸培养基或噻吩-2-羧酸肼培养基，观察细菌生长。菌型鉴定的方法有：①在BACTEC培养基内加入硝基苯甲酸（5 μg/mL），可抑制结核分枝杆菌复合型生长，而不抑制NTM，其结果可鉴别结核分枝杆菌和NTM；②高效液相色谱、气（液）相色谱及薄层层析图谱的细胞类脂分析；③核苷酸探针杂交技术；④聚合酶链反应（PCR）、PCR-限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）分析。
4 NTM的药物敏感性
随着NTM感染情况日益严重，对NTM病可靠的药敏试验、高效的化疗药物，已成为当前NTM病研究的主要课题。虽然分枝杆菌药物敏感性测定已积累了大量的资料，但临床应用较少且多是回顾性分析，缺乏双盲试验验证。由于NTM的耐药模式可因亚群的种类不同而有所差异，所以治疗前的药物敏感试验仍然重要。药物敏感性测定是为了预期和评价放疗方案对非结核分枝杆菌病治疗的效果，一般药物活性评价包括试管内抑菌和杀菌活性测定、巨噬细胞试管内试验、产生体内条件的试管内模型试验、鼠实验性治疗和临床验证。非结核分枝杆菌药物敏感性方面与结核分枝杆菌药敏试验方法有所不同，大多数药物显示很弱的对非结核分枝杆菌的杀菌活性并显示株间的差异，如鸟分枝杆菌存在依赖性和低敏感性，成为其药物敏感性的特征。结核分枝杆菌野生株对抗结核药物的最低抑菌浓度（MIC）范围相差仅2～4倍，而鸟分枝杆菌野生株对上述药物的MIC范围则有十至百倍之多。许多NTM病患者，往往感染两种以上NTM或同一菌种的不同菌株，对抗结核药敏感性变化很大，所以单菌株药敏试验不能指导多菌种或同一菌种不同菌株感染的治疗选择。
目前NTM病的化疗仍使用抗结核药物。相对敏感的菌种如堪萨斯分枝杆菌、海分枝杆菌等对合理化疗效果满意，可选用异烟肼、链霉素、乙胺丁醇、氨硫脲，也可选用环丝氨酸、卷曲霉素、喹诺酮类、磺胺类等。新大环内酯类药是治疗MAC的主要药物，可联合其他抗结核药物。对龟分枝杆菌及脓肿亚种分枝杆菌也可选用新大环内酯类药。多数NTM病对抗结核药物耐药，其耐药相关基因的突变位点、突变类型、发生频率及其特异性、敏感性及多个耐药基因之间的相互作用尚有待进一步明确。
NTM的获得性耐药，多由使用单一药物预防及治疗引起，从而提示必须联合用药。NTM细胞表面的高疏水性及细胞壁通透屏障是其广谱耐药的生理基础，多数NTM细胞壁是抗结核药物进入细胞的屏障。为了克服此屏障，主张应用破坏细胞壁的药物如乙胺丁醇与其他机制不同的药物如链霉素、利福平、环丙沙星等联用。