自噬系统与肌萎缩侧索硬化症

ALS患者中5%～10%为家族性ALS（FamilialALS，fALS），fALS可由超氧化物歧化酶I（Super Oxide Dismutase1，SOD1）、TARDNA结合蛋白-43（Transactivating Response DNA Binding Protein43，TDP-43）、C9orf72（Chromosome 9 Open Reading Frame72）、肉瘤融合蛋白（Fusedinsarcoma，FUS）、动力蛋白激活蛋Ⅰ（Dynactin1，DCTN1）和视神经蛋白（Optineurin，OPTN）等多种基因突变引发。现研究发现，fALS和散发性ALS（SporadicALS，sALS）受损运动神经元中出现溶酶体数量和功能异常。溶酶体可以广泛降解生物大分子，这对于防止细胞内受损细胞器积累和毒性产生有重要作用。而神经元是非分裂细胞，使其对蛋白质降解通路的变化尤为敏感。ALS中约97%患者的运动神经元中出现胞质不溶性包涵体，这说明ALS受损运动神经元中蛋白质产生与降解失衡。Bcl-2和BCL2L1是BECN1的负性调节蛋白，BECN1可与Bcl-2相结合形成的复合物可抑制自噬。突变的SOD1会改变BECN1水平以及BECN1-BCL2L1复合物的相互作用，负调控自噬体成熟进而影响自噬。Xie等在SOD1G93AALS小鼠出生后40天时，免疫荧光技术检测到脊髓运动神经元溶酶体中Cathepsin表达强度减弱，溶酶体功能障碍。而Bandyopadhyay等将3月龄SOD1G85R与野生型小鼠相比，前角运动神经元中脂褐质明显减少。用氯喹（Chloroquine）抑制溶酶体功能，处理小鼠2周后，突变型小鼠运动神经元中脂褐质数量增加，这说明在此突变型小鼠模型中溶酶体功能高度活化。突变的SOD1可阻碍自噬体成熟。在SOD1G86RALS小鼠模型神经元中，自噬受体蛋白BECN1表达水平增加。而减少SOD1G86R小鼠模型中BECN1的水平会延长小鼠生存期，延缓疾病起始，LC3Ⅱ水平显著下降，自噬体形成并成熟。而且SOD1G93AALS小鼠模型晚期的脊髓组织星形胶质细胞中，溶酶体相关基因表达水平增加，溶酶体的酶活性增强。TDP-43G294V引起的ALS患者早期多能干细胞分化的脊髓运动神经元中，细胞生长过程中溶酶体体积增长缓慢，移动速率减慢，运动神经元死亡数量增加。

且p62是由SQSTM1编码的多功能泛素结合蛋白，参与泛素蛋白酶体系统和自噬-溶酶体系统两种蛋白降解过程。p62作为一种信号转导途径中的支架和接头蛋白，分子结构中具有多个功能结构域可与其他蛋白质相互作用。Leibiger等研究，在酵母细胞中过表达ALS致病基因TDP-43突变会产生TDP-43胞质错位积聚，溶酶体片段化，蛋白酶Pep4（CathepsinD同源蛋白）活性显著下降，表明溶酶体功能受损。LC3作用域（LC3-Interaction Region，LIR）可与自噬体标志蛋白LC3相互作用，泛素结合区域（Ubquitin-Associated Domains，UBA）可选择性募集泛素化蛋白并传递至自噬体，经自噬途径降解，故自噬受体蛋白p62是泛素与自噬体连接的桥梁，p62以寡聚体的形式将蛋白质或细胞器的聚集体定位到自噬体结构中，能有效传递自噬底物。p62突变可引起ALS，受损的运动神经元p62功能障碍使其对泛素阳性的自噬体识别和降解受损，造成自噬异常。C9orf72突变体中GGGGCC长重复序列插入内含子，使C9orf72功能缺失可引起ALS。研究发现小鼠胚胎成纤维细胞敲除C9orf72后，免疫荧光法检测到溶酶体数量增加；脑中敲除C9orf72后，生化方法检测到LAMP1和LAMP2表达水平增加。Neuro2a细胞中过变达FUSP525L会使LAMP2水平下降。

OPTN对线粒体自噬有重要调节作用。受损线粒体中Park蛋白会从线粒体基质转移到线粒体外膜，使线粒体外膜蛋白泛素化，从而招募OPTN，OPTN还可与LC3相连，定位自噬体形成。而OPTN泛素结合区域突变会引起ALS，且与受损线粒体结合受损，线粒体自噬障碍。运动神经元病致病突变型DCTN1G59S转基因小鼠模型运动神经元中，脂褐素体积变大，数量增加且在细胞外周积聚。人原代运动神经元或NSC-34细胞中内源性OPTN与溶酶体共定位，而过表达ALS突变型OPTNE 478G或OPTN398x后，突变的OPTN与溶酶体定位较少，且自噬体积聚，自噬溶酶体数量显著减少，说明溶酶体降解功能减弱。

神经元内自噬体形成后依赖动力蛋白复合物沿微管运输到溶酶体。且运动神经元中轴突可长达1m，轴突远端受损线粒体或蛋白质被自噬体吞噬后，需在动力蛋白复合物驱动下沿微管逆向运输到近胞核区的溶酶体，故动力蛋白和动力蛋白激活蛋白对于自噬有重要作用。而ALS中Dynactin1突变或表达水平下降会抑制其正常功能，损伤自噬体运输。幼年大鼠脊髓组织中注射sALS患者脑脊液（ALS-CSF）后，活性氧水平增加，线粒体功能受损，并且溶酶体酶如HexosaminidaseA（HEXA）和B（HEXB）、Arylsulphatase-A（ARS-A）和B（ARS-B）以及唾液酸酶（Sialidase）等水平显著下降，溶酶体功能障碍。Rab1可调节细胞内膜运输，如内质网-高尔基体间运输和自噬体形成。研究发现，FUS突变引起的ALS的早期，运动神经元中自噬体蛋白ATG9与LC3共定位受损，自噬体不能正常形成，而过表达Rab1后可以恢复自噬体的形成，这提示ALS中突变的FUS通过抑制Rab1的活性来负调控自噬体形成。细胞外周溶酶体较近核溶酶体酸性较弱，溶酶体酶活性较低，水解活性降低，这是由于外周溶酶体中H+泵活性下降，且H+泄露程度更高。神经元中溶酶体可沿微管进行双向运输，当溶酶体在Dynein和动力蛋白激活蛋白Dynactin复合物的驱动下逆向运输到细胞核周围，才具有完全的水解活性。此外，C9orf72也与Rab1a相互作用，进而调控Rab1a依赖的自噬起始复合物ULK1的运输，促进自噬前体的形成。ALS中C9orf72表达水平下降或功能缺失会抑制自噬体形成起始复合物。而ALS中轴突运输障碍会引起溶酶体病变。ALS致病基因SOD1突变引起的ALS小鼠模型在疾病症状发生之前，神经元轴突运输缺陷。突变的SOD1可以竞争晚期内体与动力蛋白复合物的接头蛋白质Snapin与Dynein结合，会减弱晚期内体逆向运输与溶酶体结合，进而抑制溶酶体成熟，使溶酶体功能障碍。研究发现，SYSY细胞中敲减TDP-43可使转录因子TFEB从胞质转移到胞核及溶酶体，促使自噬体和溶酶体合成增多，但由于Dynactin1表达下降使自噬体运输受阻，二者融合过程受到抑制，导致自噬体及其包裹的受损细胞器或蛋白积聚，自噬功能障碍，可能引起神经毒性，使细胞受损。DCTN1突变引起ALS患者中神经元中逆向运输受损。线虫运动神经元中特异性敲减DNC-1（Dynactin1的同源蛋白）后，受损胞内轴突运输受损，线虫运动功能障碍。这提示DCTN1突变型ALS受损运动神经元中，溶酶体的轴突逆向运输受损。VCP可通过调控mTOR活性来影响自噬。VCP突变引起的ALS小鼠模型中mTOR活性减弱使蛋白质合成减少，自噬体合成增多。且VCP突变会抑制自噬体与溶酶体的融合，使自噬体成熟受阻，自噬失调。ALS中TDP-43突变或功能缺失也会调控Dynactin1的表达引起溶酶体定位异常。研究发现，SH-SY5Y细胞中敲减TDP-43可使Dynactin1表达下降，溶酶体逆向运输受阻，细胞外周溶酶体数量增加，而自噬体和溶酶体融合减少。过表达Dynactin1会恢复TDP-43缺失细胞中溶酶体与自噬体的融合。这提示TDP-43通过Dynactin1依赖方式调控溶酶体运输和定位。

此外，VCP是线粒体自噬相关蛋白Parkin的下游分子，可以被招募到损伤线粒体外膜。VCP突变或功能缺失也会使PINK1-Parkin通路自噬体成熟受损，引起自噬异常。微管脱乙酰酶HDAC6具有泛素结合活性，且与微管和纤维状肌动蛋白（Fibros Actin，F-actin）细胞骨架相互作用，故其可以与泛素化阳性错误折叠蛋白相结合，使其沿微管运输形成积聚，且HDAC6可以促进自噬体沿微管运输与溶酶体结合形成自噬溶酶体。溶酶体与自噬体融合受损。OPTN和肌球蛋白Ⅵ（Myosin Ⅵ）共同调控细胞中内体、分泌囊泡和自噬体等的运输。OPTN作为接头蛋白将货物与Myosin Ⅵ结合，并激活Myosin Ⅵ二聚化后沿微丝运动。正常情况下，OPTN是自噬受体，可与自噬体结合后使其运输到溶酶体后二者结合。研究发现，TDP-43缺失的细胞中HDAC6水平下降，使ALS相关突变的SOD1积聚形成受损，自噬体与溶酶体融合受阻，负调控错误折叠蛋白积聚体的形成和降解。SOD1G93AALS小鼠模型中HDAC6对自噬也具有重要调控作用。SOD1G93A小鼠出生后120天脊髓中HDAC6蛋白及其mRNA水平显著下降。(https://www.daowen.com)

ALS中OPTN突变位点主要位于其与Myosin Ⅵ结合区域，细胞中沉默或突变的OPTN不能与Myosin Ⅵ、自噬体和溶酶体相结合，sALS患者脊髓组织中也发现OPTN与Myosin Ⅵ结合减弱，自噬体与溶酶体的融合过程受阻，从而使自噬溶酶体形成减少，溶酶体不能发挥水解功能。而过表达HDAC6后可以保护运动神经元，提高自噬活性，减少自噬体和SOD1积聚，延长ALS小鼠生存期。溶酶体合成异常。ALS致病基因C9orf72是自噬的负调控蛋白。C9orf72功能缺失会使mTOR活性受到抑制，从而促进mTOR下游因子TFEB转移到细胞核，调控溶酶体基因表达，使溶酶体数量增加。而且研究发现，SH-SY5Y细胞中敲减TDP-43可促使转录因子TFEB从胞质转移到胞核，引起溶酶体合成增多。ALS受损运动神经元中溶酶体内pH或者溶酶体酶活性下降会抑制自噬功能。研究发现，ALS患者和SOD1小鼠模型受损运动神经元中中溶酶体蛋白酶Cathepsins水平异常增加，提示溶酶体功能异常。ALS相关的SOD1突变小鼠中在疾病症状发生之前，神经元轴突运输缺陷。溶酶体酶活性下降。研究发现SOD1G93A小鼠细胞中钙蛋白酶（Calpain）异常活化，可引起细胞内钙紊乱，溶酶体中钙离子释放异常，使溶酶体酸化受阻，水解功能障碍。ALS中FUS突变引起溶酶体病变与Mask蛋白水平有关。

ALS典型病理特征之一是损伤运动神经元中产生大量胞质不溶性蛋白积聚。通常情况下，细胞内错误折叠蛋白通过泛素蛋白酶体系统降解，当蛋白酶体活性受到抑制时，错误折叠蛋白发生积聚，而自噬是胞内错误折叠蛋白积聚物的主要降解途径，自噬异常使积聚物降解受损，可能通过毒性获得或功能缺失的方式使运动神经元损伤变性。突变的SOD1可以竞争晚期内体与动力蛋白复合物的接头蛋白质Snapin与Dynein的结合，会减弱晚期内体逆向运输与溶酶体结合，从而抑制溶酶体成熟，使溶酶体活性下降，造成自噬水平下降。Leibiger等研究，在酵母细胞中过表达ALS致病基因TDP-43突变会产生TDP-43胞质错位积聚，与哺乳动物细胞相似。Mask蛋白高度保守，可以促进自噬活性，减弱蛋白质积累引起的细胞变性。研究发现，在果蝇眼和幼虫肌肉中分别共同过表达ALS突变型FUSR521H和Mask可以减少光感受器变性和突变蛋白的积累，这是由于Mask可通过促进质子泵V-ATPase表达水平来提高溶酶体酸化及其活性。研究发现97%的ALS患者受损运动神经元中出现TDP-43阳性积聚。ALS受损运动神经元中磷酸化的TDP-43与p62共定位，这说明错误折叠蛋白质积聚与自噬相关。且在酵母细胞中过表达突变的TD-P43后溶酶体片段化，使溶酶体功能受损，蛋白酶Pep4（Cathepsin D同源蛋白）活性显著下降，溶酶体功能受损使自噬水平下降。此外，细胞中高尔基体膜上有M6P受体，可识别溶酶体酶上的M6P信号，具有溶酶体酶的分选功能，再以有被小泡的形式转运到溶酶体，促进溶酶体形成和成熟。研究发现，N2a和SY5Y细胞中加入自噬抑制剂3-MA会促进TDP-43全长和片段化积聚的产生；mTOR抑制剂Rapamycin诱导自噬后会加强TDP-43积聚的降解，使TDP-43移位到细胞核中行使正常功能，恢复其对mRNA加工，延长神经元存活。且ALS运动神经元中包涵体产生可伴随自噬体、溶酶体数量和定位的改变；溶酶体与自噬体融合受阻；溶酶体酶活性异常等，这提示溶酶体病变主要通过阻碍自噬-溶酶体胞内降解通路，使有害货物（错误折叠蛋白质积聚体、受损细胞等）积累而对细胞产生毒性。而ALS受损运动神经元中高尔基体碎裂，这会阻碍高尔基体对溶酶体酶的识别，使溶酶体结构和功能受损运动神经元中自噬异常可引起或加剧不溶性错误折叠蛋白质积聚，而聚集体可激活内质网应激通路，从而引起细胞凋亡。

当线粒体受损时，线粒体内膜蛋白质Prohibitin2（PHB2）被暴露于线粒体外膜，自噬体上LC3可附着于PHB2，进而携带线粒体到溶酶体。此外，OPTN也可调控线粒体自噬。

ALS运动神经元中突变的VAPB可形成集聚并招募野生型VAPB。野生型VAPB和突变型VAPB均可与TOR相互作用，但作用相反。VAPB P56S可以上调TOR信号；而VAPB WT会抑制TOR信号。TOR可以调节细胞内代谢，并且是自噬潜在抑制剂，VAPB可通过调控TOR活性影响自噬。受损的线粒体膜上PINK1蛋白积聚，PINK1可以招募E3泛素样蛋白Parkin从线粒体基质转移到线粒体外膜并磷酸化激活，活化的Parkin使线粒体外膜蛋白如Mitofusions泛素化，OPTN的泛素结合区域可以与线粒体外膜泛素化蛋白结合，LIR区域可招募LC3诱导自噬体成核来调控线粒体自噬。RNA编辑酶ADAR2参与调节ALS中自噬异常。研究发现，sALS患者脊髓运动神经元中ADAR2 mRNA水平明显减少，而ADAR2水平下降可以使AMPA受体亚基GluR2/GluR-BRNA编辑障碍，使钙离子内流通透性增加，引起钙超载，进一步使运动神经元中自噬水平异常提高，但钙超载引起自噬的具体机制有待研究。溶酶体病变可以启动或执行细胞程序性死亡。ALS运动神经元中存在不能被降解的受损线粒体会释放大量活性氧，引起溶酶体膜透化作用进而激活细胞凋亡。溶酶体功能障碍也可使细胞坏死通路相关蛋白RIPK1、RIPK3水平增加，激活坏死通路。ALS中溶酶体病变与运动神经元损伤的关系仍需深入研究。Parkin-OPTN通路可调控线粒体内稳态，是细胞早期保护机制。而ALS相关OPTN泛素结合区域突变型OPTNE478G无法结合到受损线粒体外膜，不能招募LC3，进而不能形成自噬体，受损线粒体降解障碍。细胞中大量受损线粒体使能量产生减弱、缓冲钙离子能力受损，并产生大量活性氧，使细胞处于氧化应激状态，促进细胞凋亡。目前发现，自噬与细胞的凋亡和坏死相关。自噬参与调控Caspase依赖的细胞凋亡通路。钙蛋白酶Calpain可剪切自噬相关蛋白Atg5，剪切的Atg5片段可转移到线粒体，阻塞抗凋亡蛋白Bcl功能，促进细胞色素C的释放，从而引起细胞凋亡。ALS中受损运动神经元中自噬体大量积聚，这可能是由于ALS被高度激活使自噬体生成增多，也可能是由于自噬体与溶酶体融合受损，这都可导致自噬体内包裹的待降解蛋白或线粒体大量积聚，产生毒性，使细胞变性损伤。此外，Caspase可剪切自噬体形成关键蛋白Beclin1，Beclinl的C-末端片段也可定位到线粒体，引起促凋亡因子释放。ALS中运动神经元会发生坏死。坏死是由肿瘤坏死因子（Tumor Necrosis Factor，TNF）等介导的细胞死亡方式。溶酶体参与调控蛋白质、核酸和脂质等生物大分子的降解，对于细胞中物质循环和细胞存活有重要作用。溶酶体在细胞中沿微管双向运动，在近核区活性较强。而ALS运动神经元中溶酶体的数量、定位和功能发生异常，这可能通过阻碍自噬-溶酶体降解通路或引起溶酶体膜透化作用来起始或加速细胞死亡。当TNF诱导细胞坏死后，RIP1和RIP3（Receptor Interacting Protein Kinases）相互结合形成一个信号复合体Necrosome以传递坏死信号。而研究发现Necrosome形成于自噬体积累位点，抑制自噬体合成后，坏死通路受阻。这提示ALS中自噬异常与运动神经元的凋亡或坏死有关，而自噬在细胞死亡中的作用是复杂的并且仍未明确，自噬也具有保护细胞的作用。而目前ALS中溶酶体异常与受损运动神经元的相互作用机制以及溶酶体异常是ALS的起因或结果仍未完全明确。现亟须深入研究溶酶体病变与运动神经元损伤变性的关系，及其与ALS发生发展的相关机制，以期为ALS临床防治提供思路和参考。