试剂分装及备皿标准化操作流程
实验室进行试剂的提前分装是提高实验室工作效率,并及时了解实验室各类试剂库存状态的良好途径。辅助生殖实验室使用的大多数液体均需要进行备皿预平衡后方可使用,统一标准的备皿操作也是保证胚胎培养质量的重要环节。
1.分装及备皿操作原则:
(1)质控原则:新进试剂或原有试剂批号发生变化时需对该批号试剂进行“人类精子存活实验”质量控制,质控合格后方可入库使用。
(2)无菌原则:分装、备皿的环境无菌,所用一切试剂及器皿均应保持无菌。操作过程保持无菌,操作前操作者应彻底清洁双手并擦干,对可疑污染的任何试剂或器皿应立即弃用。开启培养液时,注意手不能碰到接触培养液的瓶口部位,不能过瓶口,未用完的培养液及时紧盖并封口。
(3)无误原则:配液前明确所需培养液种类及数量,不得使用过期的、包装损坏的、可疑污染的培养液或器皿。不同厂家不同系列的培养液、血清不得混用(如加血清的培养液开封后7天或取用超过7次的应弃用,预计用不完的培养液应在打开包装时分装,无菌分装后保质期与原包装相同)。所有开启的物品均要标明开启日期。
(4)有序原则:配液时及放入培养箱平衡时各种器皿的摆放应按照不同用途、不同种类、不同日期有序分开放置。
(5)一管一液原则:同一支移液管只操作同一瓶培养液。
2.试剂分装类别及操作流程:
(1)箱外操作液:
①将备液专用超净工作台根据操作流程准备至备用状态。
②到货后根据试剂规格准备5mL带盖无菌试管若干,封口膜若干,打印箱外操作液分装标签(包括商品名、批号、分装日期、有效期)若干。
③打开商品化箱外操作液外包装后放入超净工作台,使用5mL移液器或电子移液器吸取1.5mL箱外操作液移入5mL带盖无菌试管中。
④使用封口膜对试管进行封口,粘贴分装标签,放入冰箱指定位置。
⑤分装的箱外操作液主要用于卵母细胞的处理,ICSI操作皿及剥卵皿等的制备,使用前需要进行37℃复温,不需进行CO2平衡,复温前应移除封口膜方可放入恒温箱中,如使用通气的培养箱应确保试管盖盖紧。
(2)卵泡冲洗液:
①将备液专用超净工作台根据操作流程准备至备用状态。
②到货后根据试剂规格准备14mL带盖无菌试管若干,封口膜若干,打印卵泡冲洗液分装标签(包括商品名、批号、分装日期、有效期)若干。
③打开商品化卵泡冲洗液后放入超净工作台,使用10mL移液器或电子移液器吸取10mL卵泡冲洗液移入14mL带盖无菌试管中。
④使用封口膜对试管进行封口,粘贴分装标签,放入冰箱指定位置。
⑤分装的卵泡冲洗液主要用于取卵手术中的润洗取卵针及冲洗患者卵泡,使用前移除封口膜后加入肝素钠,使肝素钠终浓度为10IU/mL,之后盖紧试管盖在取卵手术室恒温试管架上进行37℃复温,备用。
(3)精子分离梯度液:
①将备液专用超净工作台根据操作流程准备至备用状态。
②到货后根据试剂规格准备15mL锥底带盖无菌离心管若干,封口膜若干,打印梯度离心液上层、下层分离液标签(包括商品名、分装日期、有效期)若干。
③打开商品化梯度分离液后放入超净工作台,使用5mL移液器、电子移液器或3mL塑料移液吸管吸取2mL上层/下层梯度液后移入15mL锥底带盖无菌离心管中,拧紧管盖。
④使用封口膜对离心管进行封口,粘贴分装标签,粘贴标签时应注意分辨上层或下层梯度液,放入冰箱指定位置。
⑤分装的梯度分离液主要用于精子的优化处理,每个标本需要使用上层下层两管试剂,使用前需要进行37℃复温,不需进行CO2平衡,复温前应移除封口膜方可放入恒温箱中,如使用通气的培养箱应确保离心管管盖盖紧。
(4)洗精液:
①将备液专用超净工作台根据操作流程准备至备用状态。
②到货后根据试剂规格准备15mL锥底带盖无菌离心管若干,封口膜若干,打印洗精液标签(包括商品名、批号、分装日期、有效期)若干。
③打开商品洗精液后放入超净工作台,使用10mL移液器或电子移液器吸取6mL洗精液后移入15mL锥底带盖无菌离心管中,拧紧管盖。
④使用封口膜对离心管进行封口,粘贴分装标签,放入冰箱指定位置。
⑤分装的洗精液主要用于精子的优化处理,包括上游法和梯度离心法,使用前需要进行37℃,6%CO2平衡至少6h后使用(不同品牌的洗精液有时预备条件有所不同,具体使用方式应参考试剂说明书),复温前应移除封口膜方可放入恒温箱中,放入培养箱时将离心管管盖拧松。
⑥部分实验室使用受精液或箱外操作液完成洗精工作,也可满足日常精子优化处理效果。
(5)透明质酸酶:
①将备液专用超净工作台根据操作流程准备至备用状态。
②到货后根据试剂规格准备1.5mL带盖无菌无酶离心管若干,封口膜若干,打印透明质酸酶标签(包括商品名、批号、分装日期、有效期)若干。
③打开商品透明质酸酶后放入超净工作台,使用200μL移液器吸取150μL透明质酸酶后移入1.5mL带盖无菌无酶离心管中,盖紧管盖。
④使用封口膜对离心管进行封口,粘贴分装标签,放入冰箱指定位置。
⑤分装的透明质酸酶主要用于卵母细胞及受精卵剥离颗粒细胞,将透明质酸酶在培养箱中复温37℃,在培养皿中制作150μL体系的液滴后应尽快使用。
(6)精子制动液:
①将备液专用超净工作台根据操作流程准备至备用状态。
②到货后根据试剂规格准备1.5mL带盖无菌无酶离心管若干,封口膜若干,打印透明质酸酶标签(包括商品名、批号、分装日期、有效期)若干。
③打开商品精子制动液后放入超净工作台,使用200μL移液器吸取200μL精子制动液后移入1.5mL带盖无菌无酶离心管中,盖紧管盖。
④使用封口膜对离心管进行封口,粘贴分装标签,放入冰箱指定位置。
⑤分装的精子制动液要用于进行ICSI操作时制作ICSI操作皿进行精子制动,使用时需在培养皿中制作150μL体系的ICSI操作滴,制作液滴后在培养箱中复温37℃后应尽快使用。
3.培养皿制备类型与操作流程(https://www.daowen.com)
(1)洗卵皿:
①在35mm培养皿中加入2mL受精液(含蛋白)后放入37℃,6%CO2培养箱中平衡过夜。
②用途为捡卵操作后尽量去除卵冠丘复合体的箱外操作液及残余红细胞。
(2)ICSI操作皿:
①于ICSI操作前一日在皿底如图5.1位置和形状加入受精液制作薄滴后覆盖矿物油5mL,在37℃6%CO2培养箱中平衡过夜。
②在ICSI操作日,使用ICSI操作皿前用巴斯德吸管将皿内原来的薄滴吸掉,再使用制动剂PVP(商品化PVP较为浓稠,可根据个人情况添加适量箱外操作液进行恰当稀释,以避免PVP对注射针及卵母细胞产生不利影响),在PVP液滴旁8个液滴将原受精液液滴吸出并更换为50μL箱外操作液液滴备用(图5.2)。
图5.1 ICSI操作皿制作图示
图5.2 ICSI操作皿制作图示(换液)
③换液操作后放入培养箱保温备用。
(3)洗精液小管/睾丸穿刺皿:取分装好的洗精液后根据次日决定的精液处理方式进行再次分装:
①洗涤上游法:从含有6mL洗精液的15mL锥底离心管中吸出3mL及2mL两份分装于5mL带盖试管,将剩余的1mL留于15mL锥底离心管中,将管盖拧松后放入37℃,5%CO2培养箱平衡备用。
②密度梯度离心法:将含有6mL洗精液的15mL锥底离心管去除封口膜拧松管盖后放入37℃,6%CO2培养箱中平衡备用。
③睾丸组织及附睾精液:制备睾丸穿刺皿,从含有6mL洗精液的15mL锥底离心管中吸出1.5～2mL加入35mm培养皿中,放入37℃,6%CO2培养箱平衡备用,将剩余液体留于15mL锥底离心管中,将管盖拧松平衡备用。
(4)受精皿/ICSI孵育皿:
①取中央井培养皿,吸取700μL受精液加入中央井皿内圈,吸取500μL矿物油盖于受精液之上。
②在中央井外周加入2mL受精液不盖油,置于37℃,6%CO2培养箱中平衡过夜。
(5)卵裂胚培养皿/囊胚培养皿(解冻胚胎培养皿):
①使用钻石笔在60mm培养皿底进行画线标号(图5.3)。
图5.3 卵裂胚培养皿标记示意图
②在皿底上1/4处加入500μL卵裂胚培养液/囊胚培养液,从上部500μL的大滴中分别取20μL在标号处制成小滴,加入5mL矿物油,大滴剩余的液体可用于洗涤受精卵。
③日常工作中,囊胚培养皿或解冻胚胎培养皿中培养的胚胎远少于培养的卵裂胚,因此在工作中也可采用35mm培养皿进行备皿,使用35mm培养皿时需要加入3～4mL矿物油(图5.4)。
图5.4 35mm培养皿标记示意图
④将备好的培养皿置于37℃,6%CO2培养箱中平衡过夜。
(6)时差培养皿:
①取时差培养皿,再使用100μL移液器吸取25μL全程培养液加入最左右两侧的四个洗涤井中。
②取剥卵针从洗涤井中吸取适量培养液小心加入每个培养井底部的微孔中,以培养井内液体加满产生半圆形表面张力液滴为宜,应注意严格避免产生气泡。(图5.5)
③再使用100μL移液器吸取25μL全程培养液缓慢加入时差培养皿的每一个培养井中。
④加满后在体视显微镜下确认培养井底部微孔是否有气泡残留,如有残留,使用剥卵针针尖将气泡挑出后,在培养液上方加入1.5mL矿物油后盖盖,放入37℃,6%CO2培养箱中平衡过夜。(图5.6)
图5.5 时差培养皿微孔加液示意图
图5.6 时差培养皿显微镜下状态
⑤使用前再次确认微孔附近是否残留气泡,如有应及时处理。
(7)移植皿:
①取中央井培养皿,吸取1mL囊胚培养液或胚胎胶加入中央井培养皿的内圈,不盖油。
②在中央井培养皿外周加入2mL囊胚培养液或胚胎胶,不盖油,置于37℃,6%CO2培养箱中平衡过夜。
③移植皿的用途包括新鲜移植、囊胚移植及解冻移植等。
4.试剂分装及备液注意事项:
(1)进行培养液准备时,所有培养液必须在冷台面上配制或分装,避免水分蒸发。操作要迅速,减少因培养液蒸发引起渗透压改变,减少开封的培养液在冰箱外的暴露时间。
(2)需要在37℃,6%CO2培养箱平衡后使用的试剂,原则上平衡时间如超过48h则不再使用。
(3)试剂分装时间每周固定一日进行,需至少备齐下一周的所有试剂,备皿平衡等操作一般于每日下午3:00～5:00进行,应逐项确认完成,避免发生不必要的损失。
