精液处理标准化操作流程
根据工作安排,精液处理应在当日所有患者取精结束后统一进行,传染病阳性患者的样本应单独排到最后处理。精液处理前进行精液评价,根据当日患者数量、精液分析结果等因素选择不同的精液处理方案。针对手淫取的精液,处理方式一般分为密度梯度离心法及洗涤上游法两种,两种精液处理方法适用于IUI,IVF-ET及ICSI等操作的精源供给,针对活检取得的精子使用相应的精子处理方式,穿刺获得的精子只能用于ICSI操作。
1.精液处理实验准备:
(1)密度梯度离心法:
①密度梯度液:上层液和下层液各分装2mL每人份,分装至15mL离心管中,储存于4℃冰箱,使用之前30min将上述液体置于37℃培养箱预热。
②洗精液:6mL每人份,分装至15mL离心管中,储存于4℃冰箱,使用之前30min将上述液体置于37℃培养箱预热。
③耗材:圆底带盖试管(5mL)、离心管(15mL)、吸管(3mL)、取精杯、精斑卡、精子计数板、注射器(5mL)等。
(2)洗涤上游法:
①洗精受精液小管:每对患者准备两支5mL离心管,A、B管中分装3mL、2mL IVF液37℃,6%CO2培养箱平衡过夜。
②耗材:圆底带盖试管(5mL)、离心管(15mL)、吸管(3mL)、取精杯、精斑卡、精子计数板、注射器(5mL)等。
(3)睾丸/附睾穿刺精子处理:
活检皿:35mm培养皿中加入1.5mL IVF液37℃,6%CO2培养箱平衡过夜。
2.精液样本采集:
(1)根据当日取卵顺序安排患者的丈夫取精,精液收集在无菌、无毒的一次性取精杯内。取出精液后,通过呼叫系统呼叫实验室人员交接精液标本,精液标本必须亲自交给实验室人员,不得由第三人转送。
(2)实验室工作人员与取精者当场核对取精杯与实验室底册上夫妇双方姓名、年龄等内容,并通过指纹识别系统核验患者身份。检查精液杯中是否有精液样本,样本是否外泄,颜色是否异常,容器是否破损,容器内是否有明显异物等。如发生异常,应立即询问患者,并采取相应处理措施(如:重新取精)。
(3)实验室工作人员填写精斑卡基本信息后,在取精者见证下吸取一滴精液,滴于由男方签字按手印的精斑卡左侧空位内,室温保存。
(4)将精液置于室温或37℃热板上30～60min液化。若60min以上仍未液化者,可使用5mL注射器机械吹打使之液化。将混匀的精液取4.5μL滴于精子计数板上,通过精液分析仪检测精液浓度、活力等相关数据。根据精液标本参数选择适当的精液处理方法进行精子优化处理。
(5)通过活检方法获得的精子直接镜检评价。
3.密度梯度离心法分离优选精子:
(1)将上层梯度液缓慢加入下层梯度液管中,有明显液面分层,将配置好的梯度液管壁上贴上患者信息标签。
(2)双人核对梯度液试管与取精杯上名字,确认二者一致后,打开确定无菌的吸管,吸管上标记患者名字,用吸管吸取液化的精液缓缓置于配制好的梯度液上,配平,500g离心20min。
(3)用吸管吸弃离心管上部的精浆和密度梯度液,加入平衡好的3mL洗精液,将底部的精子沉淀混匀重悬,500g离心10min。
(4)用吸管去除上清液,加入平衡好的2mL洗精液,将底部的精子沉淀混匀重悬,500g离心10min。
(5)用吸管去除上清液,加入平衡好的0.5mL洗精液,轻轻吹散精子沉淀,取一滴处理后精液滴至该患者精斑卡的右侧空位室温干燥,再取4.5μL滴于精子计数板上,分析并记录优选后的精子相关数据。
(6)逆向射精精液取出后应立即进行500g离心5min处理,吸去上清后,在吸取的沉淀中加入配置好的梯度液,采取密度梯度离心法处理。
(7)将处理好的精液放回培养箱备用。
(8)关闭超净台,整理并丢弃相应废液污物。
(9)本方案在操作过程中选择了500g的离心参数,是兼顾前向精子回收率和试剂说明书的指标作出的选择,在实际操作中可根据经验适当降低离心力,或参考所应用的试剂说明书等来决定方案中的离心力与离心时间。(https://www.daowen.com)
4.洗涤上游法分离优选精子:
(1)每对患者准备两支5mL离心管,A、B管中分装3mL、2mL洗精受精液,37℃,5%CO2培养箱平衡过夜。
(2)在离心管上粘贴患者标签,并在吸管上标注患者姓名,用吸管吸取2mL精液加入2mL洗精受精液的离心管B中混匀,放入离心机500g离心10min,弃去上清。
(3)用另一个吸管吸取2mL洗精受精液加入离心管B,混匀后300g离心7min,弃去上清。
(4)将剩余的洗精受精液(0.6～1mL)沿壁缓慢加入离心管B中,放入37℃,6%CO2培养箱中静置上游20～30min。
(5)用吸管缓慢将上游液吸出(切勿吸到沉淀)移入离心管A备用。然后取4.5μL滴于精子计数板上,分析并记录优选后的精子相关数据。
(6)将处理好的精液放回培养箱备用。
(7)关闭超净台,整理并丢弃相应废液污物。
5.优选精子的浓度调整:
获得优选精子溶液后如标本前向精子浓度低于30×106/mL时可以直接进行体外受精相关操作,但精液标本精子浓度过高时,应对精子浓度进行适当调整。为避免多精受精或受精环境变差,前向精子为(5～10)×106/mL时最为理想,方法为:
(1)根据相应公式计算出精子原液及溶液使用量。
(2)取新的5mL带盖试管,加入平衡好的洗精受精液。
(3)将相应量的精子原液加入试管中轻轻混匀后,获得已知浓度的精子溶液,随后放入培养箱中备用。
6.附睾穿刺所得精子的处理:
(1)从男科手术处获得PESA(附睾穿刺取精液术)样本,置于平衡好的睾丸穿刺皿中,粘贴患者信息标签。
(2)核对姓名,取4.5μL穿刺获得的精液滴于精子计数板上,加盖玻片后进行镜检,如有必要通过精液分析仪检测精液浓度、活力等相关数据。
(3)若有活动精子,将标本置于培养箱中进行短暂培养,待行ICSI前取出进行处理。若全片均无可用精子,则通知医生进行另一侧附睾穿刺或行睾丸穿刺。
(4)行ICSI前,从培养箱中取出睾丸穿刺皿,用吸管将皿中的所有液体混匀后吸至离心管管中,500g离心5min,吸弃上清,另用一个吸管吸取少量干净培养液,滴加10滴于试管内备用。
(5)在胚胎培养实验室记录表中记录特殊来源精子获取和评价情况,配合男科手术者填写《经皮睾丸/附睾穿刺手术记录》。
7.睾丸穿刺所得精子的处理:
(1)从男科手术处获得TESA(睾丸穿刺取精术)样本,置于睾丸穿刺皿中,粘贴患者信息标签。
(2)核对姓名,取两支一次性1mL注射器在体视镜下将睾丸组织在睾丸穿刺皿中撕碎。
(3)置于倒置显微镜下镜检。先在10×20倍镜下观察有无精子,是否易找,有无活动精子。再于10×40倍镜下观察并记录精子形态。若全皿均无精子则应通知医生进行另一侧睾丸穿刺,报告无精子时应有两人以上共同确认。
(4)若有精子,将标本置于睾丸穿刺皿在培养箱中进行短暂培养,待行ICSI前取出进行处理。
(5)行ICSI前,从培养箱中取出睾丸穿刺皿,用吸管将皿中的所有液体混匀后吸至离心管管中,300g离心5min,吸弃上清,另用一个吸管吸取少量干净培养液,滴加10滴于试管内备用。
(6)在胚胎培养实验室记录表中记录特殊来源精子获取和评价情况,配合男科手术者填写《经皮睾丸/附睾穿刺手术记录》。
