体外受精标准化操作流程
1.受精方式的决定:实验室体外受精包括常规体外受精、卵胞浆内单精子显微注射(ICSI)及一半常规一半ICSI的Half-ICSI三种方案,实验室根据患者病史、医生医嘱或者当日精子情况决定最终受精方式,当常规受精失败时也可实施补救ICSI。受精方式的选择可参考下表(表5.6、表5.7、表5.8):
表5.6 少精症治疗方案
表5.7 弱精子症治疗方案
表5.8 畸形精子症治疗方案
无精子症包括以下两种:
梗阻性无精子症:P-ESA-ICSI或T-ESA-ICSI。
非梗阻性无精子症:显微取精后ICSI。
选择受精方式时优先核对是否有制定受精方式的医嘱。如有医嘱遵照医嘱执行,患者优化处理后精子质量未达到医嘱标准时,通知医生将使用下一等级治疗方案,如将常规体外受精改为ICSI;如未有特殊医嘱,将精子优化处理并对照表格选择合适的受精方式后,填写《受精方式变更知情同意书》转交当班护士,如选择ICSI则提醒护士收取“卵母细胞胞浆单精子注射费”,完成以上工作后实施相关技术操作。
2.常规体外授精标准化操作流程:根据卵母细胞成熟情况及精液处理时间,在卵母细胞培养后4～6h内(或在hCG时间后38～40h期间)进行常规体外授精,以每天8:30开始第一台取卵手术为例,最晚每天14:30前进行第一批授精,授精遵循双人配合、双人核对原则,两人应互相提醒,互相督促,按时授精。
(1)常规体外授精实验准备:
①打开风机,打开体视显微镜、热台及光源,使授精专用IVF工作站处于工作状态。
②备好授精患者的《实验室记录》,确认夫妇双方姓名,检查已勾选的授精方式,签字登记授精者,核对授精者、授精时间。
(2)常规体外授精操作:
①体外授精应严格执行双人核对原则,由两人共同进行。A负责告知拟授精人的姓名、卵母细胞存放位置、一共有几个皿、加精量,两人与《辅助生殖实验室记录》上的姓名进行核对,再与授精皿上的患者夫妇姓名进行核对。
②两人确认无误后由B进行加精子操作。取出处理好的精液,精子处理后PR浓度应在(1～3)×106/mL范围内,如大于此范围,应对获得的精子进行稀释至以上范围内。稀释测量浓度后进行体外授精时根据以下速算表进行加精,加精时应从原有体系中吸出相应加精体积的授精液,保证每个授精体系中至少含有30万条PR精子(50μL微滴授精除外,应调至每滴5000～10000条PR精子)。为方便计算可对照《加精速算表》(表5.9),计算好需添加的精液量。
表5.9 授精速算表(体系中含30万条精子所需精液添加量)
③与此同时A应密切注意B的操作,保证其操作无误。受精前核对受精皿及精液管上的患者夫妇双方姓名,无误后方可加精。
④B将受精皿放在体视显微镜下,混匀精子,按量吸取精子后加入受精皿中央滴远离卵丘团的一端,观察精子加入后是否有云雾状。
⑤以防遗漏未受精之卵母细胞,对于精子浓度低的患者,体视镜不能确认精子浓度时加完精子后应使用倒置显微镜观察。
⑥确认无误后将已用吸管弃之。随后迅速将受精皿放入37℃、低氧环境培养箱中静置4～6h,并记录加精时间及培养箱位置。
⑦两人一起再次核对无误后将精液放回试管架,移液枪、枪头放回原位,清理台面,进行下一位患者的受精操作。
⑧在全部受精结束后,两人应一起核对所有已受精人数,并与精液处理岗人员确认。
⑨整理好相应材料,登记受精方式和已受精人数,以供后续人员核对用,清理台面。
3.卵胞浆内单精子显微注射(ICSI)操作流程:卵母细胞浆内单精子显微注射适用于严重少、弱精子症,睾丸或附睾活检有精子的无精子症,严重畸形精子症,有既往IVF常规受精失败史或低受精率(2PN受精率＜20%)史及某些不明原因不孕等的患者。
(1)ICSI实验准备工作:
①仪器设备:超净工作台、CO2培养箱、体式显微镜、倒置显微镜、显微操作仪、热台、减震台。
②实验耗材:矮壁培养皿、35mm培养皿、移液器、枪头、巴斯德吸管、剥卵针、持卵针、注射针。
③试剂:箱外操作液、聚乙烯吡咯烷酮(7%PVP)、透明质酸酶、卵裂胚胚胎培养液、辅助生殖用油。
④预热以上所有试剂。
(2)ICSI标准化操作流程:
①剥卵:实施ICSI之前需获得“裸卵”进行ICSI操作,制备方式采用透明质酸酶消化法进行颗粒细胞去除。
图5.7 剥卵皿制作布局
a.剥卵皿制作:如图5.7,取100mm皿,在皿底12点位置滴加透明质酸酶150μL左右,制作剥卵微滴,在其下方使用箱外操作液制作若干50μL左右的操作微滴,放在37℃操作台上备用。(每微滴最多消化10个卵左右,如超过10个卵母细胞应相应增加剥卵微滴,制作好的剥卵皿应在30min内使用)。(https://www.daowen.com)
b.去除卵丘颗粒细胞:将卵母细胞培养1～2h后,使用巴斯德吸管吸取5～8个卵置入透明质酸酶微滴中反复吹吸,使大部分卵丘细胞脱离(30～60s,时间以卵母细胞脱去颗粒细胞的程度自行掌握)。当消化至仅剩余卵和周围的放射冠时,迅速将卵母细胞转移到下方的箱外操作液微滴中,随后换用200μm左右口径的粗尖巴斯德吸管将卵母细胞移到干净的箱外操作液微滴中。
(a)先用口径为160～180μm的细尖巴斯德吸管“粗拆”,再换用口径为135～140μm商品化剥卵针连续轻柔吹打,边吹边吸,边更换新的液滴,直至脱去颗粒细胞,使卵母细胞“裸露”出来。
(b)最后用新的粗尖巴斯德吸管将卵母细胞洗涤3～5次,然后将“裸卵”移入卵裂胚培养皿(ICSI孵育皿),贴上患者标签,随后进行卵母细胞成熟度的评价。
②卵母细胞成熟度的评价:剥卵后应对“裸卵”置于10×20倒置显微镜下进行分期评价,一般可见以下几种情况,根据形态分类的具体原则如下(如图5.8):
图5.8 各时期卵母细胞图示
MII期卵母细胞:ICSI操作应选择MII期卵母细胞,即成熟卵母细胞,形态特征为在透明带中可见第一极体的排出。
MI期卵母细胞:MI期形态特征为卵母细胞质中生发泡消失,但仍未排出第一极体,培养6～12h后可能成熟,属于欠成熟卵母细胞。
GV期卵母细胞:形态特征为卵母细胞质中可见一个大核,即生发泡,可尝试体外成熟24h,但成熟率较低。
退化的卵母细胞:形态特征为卵母细胞质色泽暗淡,形态较差,是因过成熟或其他原因发生退化的卵母细胞,一般情况下难以受精。
空透明带:剥卵后有时可见空透明带,而透明带内无卵母细胞细胞质,应如实记录。
评价结束后将ICSI孵育皿置于37℃,5%～6%CO2培养箱中孵育1h后方可进行ISCI操作。
③ICSI操作:
a.ICSI皿制作:从平衡培养箱中取出前一日制作的ICSI皿半成品,放在恒温热台上;在使用前用巴斯德吸管将皿内原来的薄滴吸掉,再使用预热好的制动剂PVP(商品化PVP较为浓稠,可根据个人情况添加适量箱外操作液进行恰当稀释,以免PVP对注射针及卵母细胞产生不利影响)以及箱外操作液换掉原有的受精液滴备用。(图5.9)
图5.9 ICSI皿制作示意图
b.ICSI加精:加精前双人严格核对患者姓名,确保无误方可加精,方法如下。
(a)极重度少弱畸形精子症及手术来源的标本:选取注射皿中间位置的操作液微滴吸出半量培养液加入精液标本,有活力的精子会游动到液滴的边缘。
(b)其他精液质量的标本取微量上游精液标本加入PVP微滴内。将处理好的精液上的一个标签撕下贴在操作皿盖上。
c.ICSI操作皿置卵:双人严格核对患者姓名,其中一人大声读出ICSI操作皿上患者姓名,由另一人与ICSI孵育皿上的患者信息进行核对,确保无误后将卵母细胞置于PVP周围的箱外操作液滴中。
d.常规显微操作:
(a)安装好显微操作针,调试系统。
(b)再次核对患者夫妇双方姓名、取卵日期。
(c)洗针:在PVP滴中反复吹吸注射针,使其易于控制并去除针管壁上可能存在的有害物质,并可平衡持卵针及注射针内外压力。
(d)精子制动:精子在制动剂PVP内游动速度会降低,操作时用微调操纵杆将注射针抬起,然后放下操纵杆按压住选好的精子尾部,轻轻地划割精子尾部以制动精子。
(e)吸精子:在PVP内将制动好的精子从尾部吸入注射针,并固定在注射针的可视范围内,随后将注射针移入含有卵母细胞的操作液内。此时应在显微镜下观察针管内精子是否发生位置移动,可以通过微调显微操纵杆进一步调整并固定精子在注射针内的位置。为避免将PVP注射入卵母细胞,建议在操作液内将选好的精子吹出,然后重新回吸注射针再行穿刺。
(f)显微注射:用持卵针固定卵母细胞,将第一极体摆放在12点或6点位置上。调整微调操作杆,使极体、透明带及注射针处于同一平面上。注射针针尖位于卵母细胞的3点位置,使针尖抵在透明带边缘,将精子吹吐到针尖部位,然后稍微回吸注射器,使注射针针管内压力保持平衡以固定针尖部的精子。然后轻轻注射,将注射针刺入卵母细胞,针尖位置到达卵母细胞中部后开始缓慢回吸细胞质,直到吸破细胞膜,观察到细胞质流入针管内,迅速将回吸的卵母细胞细胞质和精子一起吹回到细胞质内。精子进入细胞质后应快速拔出注射针,避免将PVP或培养液注射入卵母细胞,随后松开持卵针释放卵母细胞,观察注射的卵母细胞细胞膜和细胞质恢复情况,观察注射部位是否有细胞质溢出。
(g)ICSI后的卵应及时移入卵裂培养液,置于培养箱内培养。ICSI过程中核对人员应协助记录卵母细胞、精子及显微穿刺情况。
(h)显微注射操作结束后,将操作皿中的卵母细胞吸出放回贴有标签的卵裂胚培养皿中,在洗滴中尽可能将原液体洗涤干净,并将每一个卵母细胞放入一个干净液滴中,再放入37℃,6%CO2培养箱中培养至次日进行原核观察,卵在培养箱外操作时间不超过5min。
(i)显微注射结束后,将腾空儿标注好患者双方姓名的中央井皿与移入胚胎的35mm培养皿一同放回培养箱中进行培养,以备次日观察受精和污染情况。
e.TESE,TESA,PESA或极度少弱精患者的显微操作:
(a)由于这类病人的精子活动力差,所以在进行ICSI时先将精子置于箱外操作滴中,精子要加适量,若加过多则会有过多细胞成分粘针、堵针,干扰操作。最好选择游到滴边上的精子。
(b)这类患者加精液的箱外操作滴可以做成边缘凹凸不平的形状或伸出“触角”,以便精子可以游到远离红细胞和精液残渣的地方。
(c)若病人卵多,或精子难找,操作时间较长,建议更换操作滴。
4.Half-ICSI受精:Half-ICSI受精不是常规治疗方式,应有特殊指征时方可选择。它指的是将患者一半数量卵子用于ICSI,另一半数量的卵子用于常规体外受精,主要适用于获卵数较多且多次IVF未孕等指征的患者,应慎重选择。
(1)确认夫妇双方姓名,核对已勾选的受精方式,常规受精和ICSI受精的卵母细胞数量,登记受精人、受精时间。
(2)待ICSI的卵母细胞取出后剥卵,放入卵裂液中,行ICSI。遵照ICSI操作流程执行,将确定剩余行常规受精的卵母细胞存留在受精皿中,按“常规体外受精”步骤对剩余卵母细胞行常规受精。
5.进行体外受精操作后:体外受精操作结束后需将移出卵母细胞的洗卵皿及受精剩余的精子混悬液保存于实验室内(培养条件根据培养液要求选择室温或37℃,6%CO2培养箱),保存至本周期胚胎移植后。用途有以下几点:次日观察过夜精子,计算存活指数;当常规体外受精结果不理想时可以使用该精子进行补救ICSI;当培养体系发生微生物污染等时可以将此沉淀送微生物培养,检查微生物来源并研究解决方案。
