第二节 分子诊断
（一）肺癌的分子遗传特征
肺癌是目前全世界发病率最高的恶性肿瘤之一，在男性癌症患者中位居首位。随着全球大气的改变和吸烟人群扩增，肺癌的发生率也逐年上升，所以长时间以来科学家们将肺癌的发生归结为环境的变化和吸烟。但随着研究的深入，其遗传易感性也越来越受到人们重视。研究表明，吸烟者中只有10%～15%发生肺癌，而10%～15%的肺癌患者并不吸烟。目前，对肺癌遗传易感性的研究主要集中在代谢酶的基因多态性、对诱变剂的敏感性和DNA 修复能力及某些基因的突变或缺失等领域。
对于多数致癌物来说，无论是外源性还是内源性，在体内都需要生物转化激活或解毒。因此，在此过程中涉及的酶的遗传多态性在决定人群和（或）个体的肺癌易感性方面起到了决定性作用。目前，关于遗传学改变与烟草致癌物易感性关系的研究主要集中在细胞色素P450家族、GST 家族和NAT 家族这3类代谢酶基因。
1.P450
具有广泛作用底物的一个酶类，在致癌化合物代谢方面起着重要的作用。绝大多数化学致癌物包括内源性和外源性都需经过P450的生物转化激活。细胞色素P450（CYP）超家族有多个亚家族，在肺癌中研究最多的是CYP1A1这个多态位点。CYP1A1与致癌物苯并芘的代谢有关，决定了其遗传多态性与个体对肺癌的易感性有着密切关系。早在20世纪70年代，就已经确定CYP1A1酶活性的高诱导与肺癌发病率具有相关性。目前，报道的几个CYP1A1基因多态性中第1个得到确认的也是研究最为透彻的是其DNA序列上第3801位的T 转变为C，即MSPI 位点，但是CYP1A1 MSP1多态性在肺癌中的作用机制一直没有研究清楚。CYP1A1另外一个多态位点是CYP1A1基因7号外显子第4889位的A 变为G，从而使CYP1A1蛋白靠近血红蛋白结合域的第462位氨基酸残基从Iie 变为Val。同时大量研究表明，CYP1A1多态性和其他易感基因多态性如谷胱甘肽、S-转移酶-1、GSTM1的共同作用可以使肺癌患病率增加。
2.谷胱甘肽转移酶同工酶
谷胱甘肽转移酶（glutathione S-transferase，GST）同工酶是一类具有多种生理功能的二聚体蛋白，属于Ⅱ相代谢酶类。GST 可以催化谷胱甘肽与多种致癌物的亲电子和疏水化合物间的反应，通过GSTM 和GSTP 苯并芘二醇氧化可以使致癌物失活。GSTM1含有3个等位基因：GSTM1A、GSTM1B 和GSTM1缺陷型/空白型（GSTM1 null），其中空白型不表达GSTM1，不具备解毒功能，因此空白型与肺癌发病风险密切相关。特别是在暴露于环境烟草烟尘中的不吸烟者中，携带GSTM1纯合缺陷基因型的个体与杂合或者纯合野生型GSTM1基因的个体相比，其患肺癌的风险显著升高。对GST 家族其他同工酶多态性的研究表明，携带GSTP1*B/*B 基因型的个体患肺癌的风险相对携带GSTP1*A 等位基因的基因型个体增加了2倍，并且主要与小细胞肺癌相关。
3.NAT2基因
进入人体的致癌物需要通过酶灭活减轻致癌物的毒性，在芳香、杂环胺和肼类中，N-乙酰基转移酶2（N-acetyltransferase2，NAT2）基因编码的Ⅱ相外源性代谢酶通过N-乙酰化和O-乙酰化代谢对致癌物的灭活起着非常重要的作用。NAT2基因多态性主要存在7个突变位点，某些位点突变引起的NAT2乙酰化状态的改变可以降低其酶的活性，导致机体解毒效率降低、患癌症风险增加。到目前为止，已确定的人类36个NAT2基因变异体中，NAT2*4是最常见的等位基因，其与快速乙酰化相关。NAT2等位基因的分布有较大种族和地域间差异，是否与肺癌相关目前尚有分歧。早期研究认为，NAT2表型与肺癌的发生无关或影响很小，但表型研究只是对乙酰化活性进行检测。随着分子生物学技术在临床上的应用，人们发现具有NAT2快速乙酰化的吸烟者与肺癌的易感性有相关性。
4.其他代谢酶类
髓过氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）是一种存在于巨噬细胞和中性粒细胞中的代谢酶，属于Ⅰ类代谢酶，与羟基基团的形成和吸烟有关的许多前致癌物包括苯并芘的激活有关。微粒体环氧化物水解酶（microsomal epoxide hydrolase，mEH）也是一个代谢相关酶，与苯并（a）芘生物转化有关。国内研究报道表明，mEH*2多态性可能是与吸烟有关的中国肺癌的风险因子。
5.甲基化与肺癌
大量研究表明，许多基因如抑癌基因失活或表达降低与其NDA 启动子区CpG 岛过度甲基化有关。现已确定在肺癌中有9个基因有异常的甲基化表现。
（二）肺癌的分子生物学检验
一直以来，肺癌的诊断主要依靠影像学和组织病理学。虽然影像学和细胞学用于肺癌早期的检测具有一定灵敏性，但对降低肺癌患者病死率的作用并不大。而发展特异性分子标志作为影像技术的补充可能会降低肺癌患者的病死率。分子生物学检验的优势不仅在于早期诊断，而且可以对肺癌患者的预后做出评估，也可以通过筛查特异性指标指导靶向治疗，还可以较早地发现微小转移的癌灶。
1.EGFR 基因检测
原癌基因表皮生长因子受体（EGFR）在大多数NSCLC 中过表达。EGFR 是表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）相关酪氨酸受体家族的成员，通过与配体的结合，受体同源和异源二聚体化，从而激活受体内源性的酪氨酸激酶，并引发下游信号级联反应，主要包括Ras-Raf-MAP 激酶信号通路、PI3K-Akt 信号通路和STAT 通路。这些信号通路对细胞的增生、分化、迁移和血管生成有很强的刺激效应。目前，已知大部分NSCLC 均存在EGFR 过表达，其中磷癌表达率为85%，腺癌和大细胞癌表达率为65%，而小细胞癌的表达率较少。有研究表明，当检测出EGFR 基因的T790M 与20-Ins 位点发生突变后，EGFR-TKIs 疗效不佳。还发现MET 基因扩增与耐药有关。EGFR蛋白过度表达在NSCLC 患者中非常普遍（40%～80%），且与侵袭性和预后不良有关。EGFR 蛋白水平和EGFR-TKIs 敏感性的关系是研究的热点，正相关和负相关都曾经有报道，矛盾结论的来源可能归咎于用于EGFR 蛋白的定量方法学（IHC）不同，包括不同的实验室使用不同的抗体、打分标准及操作过程。EGFR 蛋白通常与EGFR 基因的拷贝相关。所以，FISH 和IHC 双阳性患者（约23%）可能从EGFR-TKIs 治疗中获益。(https://www.daowen.com)
2.K-ras 基因检测
ras 基因特别是K-ras，与肺癌的发生及预后有关。有20%～30%的NSCLC 患者存在Kras 基因突变，80%～90%的突变是由第12密码子G →T 引起的，导致K-ras 蛋白组成性活化。K-ras 基因突变会导致肺癌患者对EGFR-TKIs 产生耐药，对其突变的检测可辅助临床医师筛选受益于EGFR-TKIs 的非小细胞肺癌患者。NCCN《非小细胞肺癌临床实践指南》（V2.2011）明确指出：当K-ras 基因发生突变时，不建议使用EGFR-TKIs 靶向治疗药物。
3.甲状腺转录因子1
甲状腺转录因子1（Thyroid Transcription Factor-1，TTF-1）是一种分子量为38～40kD 的核蛋白，在胎儿肺组织和成人Ⅱ型肺泡上皮中存在，而在Ⅰ型肺泡上皮中不表达。TTF-1的阳性表达是肺腺癌特异的免疫组化诊断标志物，有助于转移性腺癌和原发性肺腺癌的鉴别。此外，TTF-1表达阴性的患者罕见EGFR 基因突变，这也意味着肺癌族中TTF-1高表达可能是预测肺癌EGFR 基因突变的一个良好的免疫组化指标，可以推测TTF-1高表达则EGFR 突变率高，可能是肺癌患者服用EGFR-TKI 类药物的优势人群特征之一。TTF-1和NKX2-8基因共活化的肺癌细胞株显示对以顺铂为主的NSCLC标准治疗耐药。目前，对TTF-1与肺癌预后之间的关系无明确结果。
4.癌胚抗原
癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）是表达于胎儿上皮细胞的一种糖蛋白，分子量为180kD。其在成人结肠正常黏膜上皮和其他组织中也有极低的表达，在胃肠道腺癌（包括胰腺癌）、肺腺癌和甲状腺髓样癌中高表达，主要用于检测上皮性肿瘤，尤其是腺上皮来源的腺癌。CEA水平在肺腺癌中升高最为明显，表明CEA在鉴别肺部的良、恶性肿瘤及其组织学分型中具有重要的作用。CEA可作为肺癌患者胸腔积液检测的最佳肿瘤标志物。
5.神经元特异性烯醇化酶
神经元特异性烯醇化酶（neuron specific enolase，NSE）是烯醇化酶的一种同工酶，以多种二聚体的形式存在，特异地定位于神经元及神经内分泌细胞内。其在肺癌组织中含量较正常肺组织中高很多，当这些肿瘤细胞解体时，NSE 即释放入血。小细胞肺癌属神经源性肿瘤，免疫组化和放免研究显示，小细胞肺癌患者NSE 阳性率为60%～80%，非小细胞肺癌患者阳性率小于20%。NSE 有助于小细胞肺癌的诊断以及其与非小细胞肺癌的鉴别诊断。NSE 用作肺癌（尤其是小细胞肺癌）的监测、疗效判定等的指标，其价值还是值得认可的。
（三）肺癌远处转移的分子标志物
肺癌的远处转移也是一个影响患者预后的重要因素。据报道，小细胞肺癌（SCLC）在确诊时有50%～70%的患者已经出现远处转移，从而失去外科治疗的机会。虽然Ⅰ、Ⅱ期和部分Ⅲ期非小细胞肺癌（NSCLC）患者在确诊时有外科治疗指征，但术后5年生存率仅有50%～70%（Ⅰ、Ⅱ期）和20%～30%（Ⅲ期）。大部分患者在原发肿瘤切除后出现肿瘤复发，而肿瘤复发首先表现为癌细胞的转移。围绕肺癌的远处转移，科学家们也研究出多种不同的分子标志物。
1.细胞角蛋白家族
细胞角蛋白（Cytokeratin，CK）来源于上皮组织，是真核细胞的细胞骨架中间丝蛋白中最为复杂的一类。现在已知CK 家族由20个成员组成，即CK1～CK20。CK 一般在上皮组织中成对表达，特异性强。CK 的阳性表达已经成为上皮细胞及其肿瘤细胞较为敏感和特异的标记。在单层上皮中所有分泌上皮（腺上皮）均表达CK8和CK18，多数细胞还表达CK19。因此，在肺癌研究中常以CK8、CK18和CK19作为特异分子标记，其中CK19是近年来被应用较多的一种TM，被认为在NSCLC 尤其是鳞癌中有高灵敏度和特异性，但对腺癌的诊断价值方面尚存在争议。
2.组织多肽抗原
组织多肽抗原（tissue peptide antigen，TPA）是一种不含糖脂的蛋白质，即单链多肽。TPA 在细胞周期的S 期和M 期合成，当细胞处于增生分化时其浓度较高。Buccheri 等人检测了104例NSCLC 患者周围循环中的TPA，发现TPA 的阳性表达与患者的淋巴结转移有一定相关性。多个小组的研究表明，TPA 是肺癌患者疗效和预后的判断指标，连续检测TPA 对监测肺癌的播散和肿瘤复发有较好的参考价值。
3.上皮特异性抗原
上皮特异性抗原（epithelial specific antigen，EPA）是上皮组织特异表达的蛋白质，位于细胞膜或胞质中。某些EPA 可以作为肺癌微转移的分子标记，如Ber-Ep4抗原。Ber-EP4是一种多肽糖，位于细胞表面。有报道称，在NSCLC 患者原发肿瘤中，Ber-Ep4的表达率高达99%，常规HE 染色发现在淋巴结转移的肺癌患者中，Ber-Ep4的检出率为15.2%。