实训15 微生物的纯种分离（一）——平板划线分离法
实训15 微生物的纯种分离（一）——平板划线分离法
一、实训目的
（1）了解微生物分离和纯化的原理。
（2）掌握倒平板的方法和平板划线分离法的基本操作，加深对微生物的无菌操作技术的认识。
二、实训原理
微生物通常是肉眼看不到的微小生物，而且无处不在。自然界中各种微生物混杂在一起，即使取得少量的样品也是许多微生物共存的群体。因此，在微生物的研究及应用中，不仅需要通过分离纯化技术从混杂的天然微生物群中分离出特定的微生物，而且还必须随时注意保持微生物纯培养物的“纯洁”，防止其他微生物的混入，所操作的微生物培养物也不应对环境造成污染。所谓纯培养状态，也就是说培养物中所有细胞只是微生物的某一个种或株，它们有着共同的来源，是同一细胞的后代。
微生物的分离纯化是指从混杂的微生物中获取只含有一种或某一株微生物的过程，平板划线分离法是常用的方法之一。该法操作简便，首先选择适合于待分离微生物的生长条件，如营养、酸碱度、温度和氧等要求，或加入某种抑制剂以形成只利于该微生物生长而抑制其他微生物生长的环境，从而淘汰一些不需要的微生物，然后通过挑取单菌落而获得一种纯培养菌落。需要注意的是，微生物群体中经分离生长在平板上的单菌落并不一定是纯培养，因此，除观察菌落特征外，还要结合显微镜检测个体形态特征后才能确定。有些微生物的纯培养还要经过一系列的分离与纯化过程和多种特征鉴定方能得到。
土壤是微生物生活的大本营，其中微生物的种类和数量都是极其丰富的，可以从中分离纯化得到许多有价值的菌株。本实训采取两种不同的培养基从土壤中分离不同类型的微生物。
三、实训器材
1．材料
土样，牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，高氏Ⅰ号琼脂培养基。
2．器具
盛9mL无菌水的试管，盛90mL无菌水并带有玻璃珠的锥形瓶，无菌吸管，接种环，无菌培养皿，显微镜，无菌铲，无菌塑料袋。
3．试剂
10%苯酚，无菌水。
四、实训步骤
1．倒平板
将牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、高氏Ⅰ号琼脂培养基加热熔化，待冷至55～60℃时，向高氏Ⅰ号琼脂培养基中加入10%苯酚数滴，混匀后分别倒平板。
图3－17 倒平板
倒平板的方法（图3－17）：右手持盛培养基的锥形瓶置于火焰旁，用左手将瓶塞轻轻拔出，瓶口保持对着火焰；然后用右手手掌边缘或小指与无名指夹住瓶塞（如果锥形瓶内的培养基一次用完，瓶塞则不必夹在手中）。左手拿着培养皿并将皿盖在火焰附近打开一缝，迅速倒入培养基约15 mL，加盖后轻轻摇动培养皿，使培养基均匀分布在培养皿底部，然后平置于桌面上，待凝固后即为平板，并用记号笔标明培养基名称、土样编号和实验日期。
2．制备土壤稀释液
选择所需测定地点进行采样。若待测地点面积小于50m2，则按对角线三点采样；若待测地点面积大于50m2，按对角线五点采样。采样一般定点于耕作层0～20cm，先除去表土1～2cm，以无菌铲采土足量，充分混匀后用无菌塑料袋分装。记录采样地的植被分布情况，将土样带回实验室进行处理，即将同一地点3个或者5个土样各称取10g后混合均匀。称取混匀后的土样10g，放入盛有90mL无菌水并带有玻璃珠的锥形瓶中，振摇约20min，使土样与水充分混合以将微生物分散，此为10－1稀释悬液；再用1mL无菌吸管吸取1mL稀释后的土壤溶液注入盛有9mL无菌水的试管中，吹吸3次充分混匀，此为10－2稀释悬液；依次类推，将土样稀释成10－3、10－4、10－5、10－6不同稀释度的土壤溶液（图3－18）。
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图3－18 土壤稀释液的制备
3．划线
在火焰附近处，左手拿皿底，右手拿接种环，挑取上述10－4、10－5、10－6的土壤悬液一环在平板上划线，每个稀释度各做3个平板（图3－19）。划线的方法很多，但无论采用何种方法，其目的都是通过划线将样品在平板上进行稀释，使之形成单个菌落。
常用的划线方法有以下两种。
（1）交叉划线法：用接种环以无菌操作挑取土壤悬液一环，先在平板培养基的一边作第一次平行划线3～4条。转动培养皿约70°角，并将接种环上的剩余物烧掉，待冷却后通过第一次划线部分作第二次平行划线，再用同样的方法通过第二次划线部分作第三次平行划线及通过第三次平行划线部分作第四次平行划线（图3－20（a））。划线完毕后，盖上培养皿盖，倒置于培养箱中培养。
图3－19 平板划线操作
图3－20 划线法示意图
（a）交叉划线法；（b）连续划线法
（2）连续划线法：将挑取有样品的接种环在平板培养基上作连续划线（图3－20（b））。划线完毕后，盖上培养皿盖，倒置于培养箱中培养。
4．培养
将高氏Ⅰ号琼脂培养基平板倒置于28℃培养箱中培养3～5天，牛肉膏蛋白胨琼脂培养基平板倒置于37℃培养箱中培养2～3天。
5．挑菌落
将培养后长出的单个菌落分别挑取少许细胞接种到斜面培养基上，分别置于28℃和37℃培养箱培养，待菌苔长出后，检查其特征是否一致，同时将细胞涂片染色后用显微镜检查是否为单一的微生物。若发现有杂菌，需再一次进行分离纯化，直到获得纯培养。
五、结果记录
（1）是否得到了单菌落？若不是，请分析其原因并重做。
（2）分析平板上分离得到的微生物类群，并描述其菌落特征。
六、思考题
（1）为什么高氏Ⅰ号琼脂培养基中要加入苯酚？若想分离得到对青霉素具有抗性的细菌，应该怎样设计实验？
（2）如何确定平板上某个菌落是否为纯培养？请简述其方法。