浆膜腔积液的脱落细胞学检测

第二节 浆膜腔积液的脱落细胞学检测

一、制片

收到标本后立即制片，其步骤如下：

（1）将标本瓶内上部的液体轻轻倒出弃掉，保留底部沉淀。

（2）将底部的沉淀摇匀，注入2只或4只离心管内，经天平平衡后放入离心机，以1000～2000r/min速度离心5min。

（3）取出试管，将上清液全部倒出，竖起试管，除管底部有少许沉淀外，留0.5ml左右的剩余液体即可。

（4）用细吸管取少许上清液和红细胞之间的细胞层，置于涂片上，轻轻涂片数张（用推片法推成均匀的涂征）。

（5）做好涂片后，须平放于制片台上，待水分蒸发，涂片边缘开始变干之时，浸入固定液内，固定10～15min取出，待其自干就可以染色。

二、染色

脱落细胞检验常用的染色方法有巴氏染色法、苏木素—伊红染色法、瑞氏染色法及湖蓝染色法等。

（一）巴氏（Papanicolaou）染色法

此法是脱落细胞染色法中较好的染色方法。适于来自上皮及间皮组织的标本。本法显示细胞核的结构清晰，分色明显，透明度好，胞浆受色鲜艳，可用以观察女性激素水平。但染色时间长，手续繁杂，费用较高，是其缺点。

1．原理

核酸带有磷酸基，其等电点为p H1.5～2.0。因此，当p H＞2时，核酸带负电荷，能结合带正电荷的碱性染料氧化苏木素矾，而呈紫蓝色。天然苏木素的染色力弱，需经黄色氧化汞氧化成苏木素红或称氧化苏木素，才具有染色性。但苏木素红呈弱酸，其等电点为p H6.5，阳性离子电荷不强，尚需与含铝（铵明矾、钾明矾或铁明矾）金属的媒染剂结合，或带强正电荷的大分子带色体 ——氧化苏木素矾才具有亲和力，与DNA磷酸复合物牢固结合，甚至不易为醇、水所洗脱。

染色中的伊红、亮绿、橘黄等为酸性染料，俾斯麦褐为盐基染料，能与细胞中具有相反电荷的蛋白质结合而染出显眼结构。在胞浆染色中，加适量磷钨酸做媒染剂，并调整p H为5.2左右，以增加其着色力。

在染色中由于核染苏木素是水溶液，标本片应经高浓度乙醇（固定液）到低浓度乙醇逐渐入水，不宜骤然直接入水。而胞浆染液却是95%乙醇液，因此又必须由低浓度乙醇到高浓度乙醇逐渐脱水，而后完全无水，经二甲苯透明封片。否则水除不尽，二甲苯不能透入，标本浑浊不清。

2．试剂

（1）赫氏（Harris）苏木素染液：

将苏木素单独溶解于无水乙醇中10min。另将铵明矾置1000ml烧杯中，加2000ml蒸馏水，加热使其完全溶解，到90℃时加入苏木素乙醇并迅速加热至沸，离开火焰，将黄色氧化汞粉末徐徐加入并随时搅拌，加汞时应注意防止沸溢（要求容器大5倍），再继续加热其溶液呈深紫色为止，立即置冷水中冷却，以免过度氧化为棕色沉淀，次日过滤，置棕色玻璃瓶中至少2周后使用。用时将此苏木素原液加蒸馏水等量，混匀即可应用。

配制染料时，在上述200ml染液中加2ml冰醋酸或枸檬酸，能稳定苏木素染色团抗拒氧化，使之不易过染，也减少沉淀形成。但若不加酸，在其他染料配合之下，核着色较为鲜明。

（2）橘黄G6染液。橘黄G60.5g，先溶于5ml蒸馏水中，再加无水乙醇95ml，即成95%乙醇染色液，然后加0.015g磷钨酸，用时过滤。

（3）EA36EA65染液。此液由亮绿（Lighrt Green SG）、黄色伊红Y（Eosin Y）、俾斯麦褐（Bismark-brown）三种染料组成。配制时，先将三种染料各称0.5g，分别溶5ml蒸馏水中，待溶后，各加无水乙醇至100ml，分别保存于棕色瓶内备用。其配制方法见表4-2。

EA36适合染鳞状上皮细胞，分色清晰、鲜艳，但胞浆较厚的细胞或厚片则不适宜，而用EA65较好。EA36染液配成之后，应用阴道分泌物涂片预染，用磷钨酸乙醇饱和液调整其着色力，观察到能将角化前细胞染蓝、绿色，角化细胞染红色为止。

（4）稀碳酸锂溶液。在100ml蒸馏水中，加饱和碳酸锂一滴。

（5）稀盐酸溶液。0.5%～1%盐酸乙醇（70%乙醇100ml加盐酸0.5～1ml）。

（6）各种不同浓度的乙醇。若用95%乙醇配制，可按表4-3稀释，在使用中可随时用乙醇比密计校正浓度。

3．染色步骤

（1）将涂片固定15～30min，在大批普查时，可用染色架将标本片置架上，用大染色缸。

（2）加水。将已固定的涂片依次置80%、70%、50%乙醇和蒸馏水中，放0.3～1min。

（3）染核。置苏木素染液中5～10min，取出后用水冲净。浸入0.5%至1%盐酸乙醇中分色，约数秒钟，以脱去吸附过多的苏木素，迅速用水冲洗，观察涂片转为淡红色即可。

置稀碳酸锂中蓝化细胞核1min，观察涂片变蓝，然后用水冲洗。

（4）脱水。将染核后的涂片置50%、70%、80%、95%乙醇中各1～2min脱水。

（5）染浆。将由95%乙醇中取出的标本片，放橘黄G6中染色2min，然后置95%乙醇中洗涤2次。置EA36染液中染色2min，然后用两缸95%乙醇各洗涤1次。

（6）脱水透明。继续将涂片置无水乙醇（两缸）、二甲苯（两缸）中各2min。

（7）封片。用光学树脂胶加盖片封固镜检。若不需保存标本，可在标本上滴加液状石蜡1～2滴，即可镜检。若需保存时，将液状石蜡先用无水乙醇洗2次除去，再经二甲苯洗后，加树脂胶封片。

4．染色结果

上皮细胞：核染深蓝色或深紫色，核仁红色，胞浆受色，根据细胞的类型和分化程度的不同，可染成橘黄色、粉红色或蓝绿色。

红细胞：鲜红色。

白细胞：细胞浆淡蓝色、绿色，核深蓝黑色。

黏液：淡蓝色或粉红色。

注：普查工作中巴氏染色可简化如下：①涂片干燥后固定，置蒸馏水中2min。②置苏木素染液中15～20min，取出后用水冲净。③用0.5%盐酸乙醇中分色，去掉胞浆内多余的苏木素，数秒钟后取出用水洗。④置稀碳酸锂溶液中蓝化1min，水洗。⑤用95%乙醇脱水2min。置EA36染色2～3min。⑥用95%乙醇洗涤2～3次，去掉多余的染料，再置无水乙醇内脱水，然后置二甲苯内透明，用树脂胶封固。

5．临床经验

（1）苏木素细胞核的时间随气温而异，冬天需时间略长，10～15min；夏天需时间短，4～5min。

（2）苏木素染色液经放置后，其表面常浮有一层带金属色泽的染料膜，在染色前应用沙纸粘去或过滤，以免粘于标本表面而妨碍检查。若染色液久用后其染料较淡时，可补加适量苏木素染色原液，以提高染色力。

（3）分色的目的。为使核的着色更具有特异性，使其与红色胞浆的对比更鲜明，因此分色的时间切勿过长，且分色完了后，要立即以水彻底洗，以免细胞核退色。但苏木素染色太深时，可适当延长在盐酸乙醇内分色时间。

（二）苏木素—伊红染色法（H-E染色）

1．原理

与巴氏染色法基本相同，所不同的是用伊红代替EA36和橘黄G6，此法常用于病理组织染色。由于此法染色透明度好，核浆对比鲜明，因此也广泛用于各种脱落细胞染色，并因染液渗透性强，适用于黏液和细胞核多的痰液涂片，效果更佳。但染液多彩性不够，不宜做细胞分化情况的观察，如阴道涂片测定激素水平。

2．试剂

伊红Y1g，加蒸馏水100ml，再加冰醋酸0.5ml，然后用玻璃棒搅拌打成泡沫状，取出泡沫置另一个容器中。继续搅拌，直到全部打成泡沫状取出。将泡沫消失后的溶液，每25ml加95%乙醇75ml。即可使用。

3．染色步骤

（1）涂片置95%乙醇和乙醚等量混合液中，固定15～30min，再置蒸馏水中1min。

（2）置苏木素染色液内染核5～10min，水冼数秒钟。

（3）置盐酸乙醇中数秒钟，水洗。

（4）置稀碳酸锂溶液中蓝化，或置自来水至标本转为蓝色。

（5）置伊红染色中染胞浆1～2min，以水冲洗去掉多余染液。

（6）依次置50%、70%、80%、95%乙醇液中脱水各30s，再置无水乙醇中1min。

（7）用二甲苯透明2次，加树脂胶封固后镜检。

（三）瑞氏—姬姆萨复合染色

1．原理

瑞氏和姬姆萨两种染色原理基本相同，而染色又各有优缺点，因此在细胞学检查中常用两者复合染色，使其取长补短，互相补充。染色结果，胞浆结果，胞浆及其中颗粒与核染色质均匀较满意。

2．试剂

（1）瑞氏—姬姆萨染液配制法：

先将瑞氏粉与姬姆萨粉放在清洁、干燥的乳钵里，加少量甲醇，充分研磨使染料溶解，将已溶解的染料倒入棕色瓶中，未溶解的再加少量甲醇溶解，甲醇全部用完为止。配好的染色液48h后可以使用，放置越久越好用。

（2）p H6.4～6.8磷酸盐缓冲液：

配好后用磷酸溶液校正p H，如无缓冲液也可用新鲜蒸馏水代替。

3．染色步骤

（1）涂片上滴加瑞氏—姬姆萨染色液适量。

（2）1min后加缓冲液适量。

（3）5～10min后倾去染液。

（4）自来水冲洗、待干、镜检。

三、浆膜腔积液细胞学检查

人体浆膜腔积液内的细胞成分有三种：间皮细胞、非上皮源的血液细胞和肿瘤细胞

（一）浆膜腔积液内的细胞

1．间皮细胞

胞体呈圆形或椭圆形，直径10~40μm，核呈圆形，直径10~20μm，多居中，亦可偏位。核染色质粗细不一，有的可见核仁。新脱落者胞质嗜碱性而染成蓝色，脱落时间较久者胞质变酸而染成淡紫红色，前者称为嗜碱性间皮细胞，后者为嗜酸性间皮细胞。

2．退化的间皮细胞

胞体增大，胞浆内有空泡，有时可将胞核推向一侧呈印戒状。由于细胞的退化程度不同，而使细胞失去了正常形态。

3．增生性间皮细胞

胞体增大，可达30~40μm，核大浆少。可为单核或双核，也可为多核。核染色质增多深染，核仁大而清晰，应与恶性细胞鉴别。

4．间皮细胞的间接分裂

间皮细胞的间接分裂，多为对称性，如间接分裂表现为非对称性或畸形的病理性核分裂，则为恶性细胞之特征表现之一，应注意鉴别。

5．组织细胞（巨噬细胞）

组织细胞的大小与间皮细胞相似，圆形或不规则形。胞核卵圆形、肾形、长圆形、常略偏于细胞的一侧，核染色质疏松呈网状，核仁可见或不明显。胞质量较丰富，灰蓝色或灰粉红色，胞质内可见紫红色细颗粒，常见泡沫状小空泡及被吞噬的红细胞、白细胞、细胞碎片及异物等。有的巨噬细胞也呈印戒样形态改变。

6．红细胞

积液中出现红细胞，表明浆膜腔有渗血或出血，多见于肿瘤、结核等。但在炎症或穿刺损伤血管时，也可出现大量红细胞。

7．淋巴细胞

其细胞形态与血中淋巴细胞相同。淋巴细胞常被用作同一涂片中测量比对其他细胞大小的“标尺”。

8．中性粒细胞

积液中的中性粒细胞主要是分叶核，所见者多有不同程度的退变。该细胞大量出现表明浆膜腔有炎症。

9．嗜酸性粒细胞

当积液中嗜酸性粒细胞＞10%时，可称为嗜酸性粒细胞增多，见于气胸、肺炎、寄生虫感染、肺梗死、肺结核以及变态反应性疾病、恶性肿瘤及药物过敏等。

10．浆细胞

少量浆细胞的出现主要见于慢性炎症、肝硬化或肿瘤等。大量浆细胞的出现可见于多发性骨髓瘤、髓外浆细胞瘤浸润浆膜腔时。

（二）良性病变所致的浆膜腔积液

1．急性炎症

急性化脓性炎症时的积液中以中性粒细胞为主，可见少量退变的巨噬细胞、间皮细胞、淋巴细胞等。所见的中性粒细胞及巨噬细胞有时可见其吞噬的细菌、真菌等。有时积液量较少，细胞成分多样，除中性粒细胞和淋巴细胞外，还有较多增生活跃的间皮细胞和巨噬细胞等。此现象可继发于肺炎、肺梗死、流感、肝脓肿等。

2．慢性炎症

涂片以淋巴细胞为主，伴有少量浆细胞及巨噬细胞等，间皮细胞增生活跃，并可出现异形间皮细胞。慢性炎症多由急性炎症转化而来，也有一些疾病一开始就是慢性过程，如结核病等。

（1）结核病。形成积液为血性、浆液性或乳糜样。涂片内可见大量淋巴细胞；间皮细胞增生，轻度异型，且成团脱落；有时见朗格汉斯巨细胞或成片干酪样坏死，但很难找到类上皮细胞。

（2）非特异性慢性炎症。涂片内可见大量淋巴细胞和成团脱落增生活跃的间皮细胞，且有中性粒细胞、浆细胞及吞噬细胞。亦可出现轻度异形间皮细胞。

（3）肝硬化。一般漏出液，涂片内细胞成分少。可见少量间皮细胞、淋巴细胞和吞噬细胞。伴有肝细胞坏死和活动性肝硬化患者，涂片内可见异形间皮细胞及较多的巨噬细胞。

（4）尿毒症。可以引起浆膜纤维素性炎症。涂片内间皮细胞增生，常成团出现，可见单核或多核异形间皮细胞。患者有明显尿毒症临床表现。

（三）浆膜腔积液内的恶性肿瘤细胞

1．积液中恶性肿瘤细胞的来源

（1）胸膜腔。如肺癌、乳腺癌、恶性淋巴瘤、恶性间皮瘤。

（2）腹膜腔。如胃癌、结肠癌、肝癌、胰腺癌、胆囊及胆管癌、卵巢癌、宫颈癌、子宫内膜、恶性淋巴瘤、恶性间皮瘤等。

（3）心包腔。如肺癌、乳腺癌、恶性淋巴瘤、恶性间皮瘤等。

（4）睾丸鞘膜。积液多属良性，恶性很少见。

2．积液内的各种类型癌细胞特点

（1）腺癌。浆膜腔积液内的恶性肿瘤细胞绝大多数为转移癌细胞（＞98%），而转移癌细胞中又绝大多数为腺癌细胞。腺癌细胞形态多样。按细胞大小可分为大、中、小3种类型。大小相差最多数十倍。按排列形式分为单个散在为主和成团细胞为主两型。单个散在癌细胞核偏位，呈圆形或椭圆形，核边不规则，染色深，核仁明显增大或多核仁，胞质中常含有空泡，常见异常分裂象。成团的癌细胞，有些细胞排列紧密，拥挤重叠；有些细胞排列疏松。胞质中见大小不等空泡。腺癌细胞排列形式多变，形成各种图案，如腺腔样、梅花状、乳头状、桑甚状、菊团状等。

（2）鳞状细胞癌。浆膜腔积液中甚少见，仅占2%～3%。分三种形态。第一种形态：为高分化鳞癌，细胞奇形怪状，胞质有角化倾向，此类所占比例最少；第二种形态：癌细胞单个散在，细胞为圆形，胞质厚实且界限清楚，核居中，核染色质深染；第三种形态，癌细胞易成团或成堆出现，立体感不明显，胞核圆形或见核仁，易误认为腺癌细胞。胸水中常见原发灶肺鳞癌，其次为食管癌。腹水中宫颈鳞癌为原发病灶常见。

（3）小细胞型未分化癌。胸水中发现比鳞癌多，为3%～5%。其特点为胞质少，在癌细胞核边缘可有少量胞质或呈裸核样。可单个散在，与间皮细胞大小相似，更多成团排列成腺腔样、链状、葡萄状或堆叠挤压呈镶嵌样。核圆形或不规则形，染色质粗大、分布不匀、深染，有时呈墨水滴状。

（4）恶性间皮瘤细胞。恶性间皮瘤细胞形态与腺癌细胞极相似，形态学上难以区分。

（5）恶性淋巴瘤细胞：浆膜腔积液中的恶性淋巴瘤细胞多从胸腹腔内淋巴结的恶性肿瘤蔓延、扩散而来，内脏的原发性恶性淋巴瘤很少见。积液中的恶性淋巴瘤以非霍奇金淋巴瘤为常见，而霍奇金淋巴瘤则罕见。形态特点：瘤细胞胞体大小不一，多呈圆形或类圆形，细胞核大而畸形，部分细胞核裂明显，具有明显的恶性肿瘤细胞特征。涂片中的瘤细胞成分较单一，散在。胞质量多少不一，胞体较小的瘤细胞有时胞质量很少似裸核。

（6）恶性组织细胞病。恶性组织细胞病也称恶性网状细胞肉瘤，实质为间变性大细胞性淋巴瘤。浆膜腔细胞学有改变者较少见。有的病人临床症状较轻，而细胞学肿瘤细胞形态呈显著的恶性改变。

3．各种常见的浆膜腔积液中转移癌细胞形态特征

（1）肺癌。是导致胸水最常见的恶性肿瘤，以周围型腺癌为多见，鳞癌和未分化癌则很少见。偶尔有中央型肺癌累及心包膜引起心包积液。

（2）乳腺癌。为导致女性胸水恶性肿瘤之一。癌细胞形态大小变化较大。乳腺导管浸润癌、乳头状癌、髓样癌和胶样癌在胸水中是大细胞型腺癌，胞核中可见两个或多个性染色质。乳腺浸润性小叶癌和硬癌是小细胞型腺癌，癌细胞常呈长链状排列，有时胞核呈长形或方形，且深染。

（3）胃肠癌。主要出现于腹水中，多数是分泌戮液的腺癌，可以见较多印戒样癌细胞，多为胃癌。大肠癌癌细胞可出现腺腔样结构或呈柱状的癌细胞团。

（4）卵巢癌。为女性腹水的常见肿瘤。以浆液性乳头状囊腺癌和薪液性囊朋翻畜多见。

浆液性乳头状囊腺癌：癌细胞呈分支状、乳头状或成团脱落。排列紧密，胞质嗜碱性，有的癌细胞团内可见深蓝色砂粒体。

黏液性囊腺癌：穿刺物是黄白色勃稠液体，涂片内可见大量淡蓝色勃液，柱状癌细胞可散在或呈小团分布，胞质内富含淡染薪液，有的呈行排列。胞核染色深，小而偏位。背景成分少，有白细胞、吞噬细胞和间皮细胞。

肝细胞癌：癌细胞体积大，呈多边形。胞质丰富，染成紫红或淡红色，常可见空泡或颗粒。核不规则形，染色质粗颗粒状，核质比增大，有明显的核仁，电镜下癌细胞中可见胆汁样物和微胆管结构。应用免疫荧光技术和抗甲胎蛋白免疫组化染色可显示癌细胞甲胎蛋白阳性。

（四）浆膜腔积液的细胞形态学报告方式

细胞形态学报告方式应写明细胞染色方法、细胞形态学特点（包括细胞图像）及检查结论。

（1）未见恶性细胞。

（2）有核异质细胞或疑为恶性细胞。

（3）找到恶性细胞。

（五）浆膜腔积液内的其他可见成分

1．胆固醇结晶

常见于有脂肪变性的陈旧性胸腔积液，胆固醇性胸膜炎所致的胸腔积液，与结核杆菌感染有关。

2．寄生虫

乳糜样积液中有时可见微丝蚴；包虫病积液中可见棘球蚴的头节和小钩；阿米巴的积液可见阿米巴滋养体。

3．细菌

感染性积液常见的微生物有脆弱类杆菌、大肠杆菌、粪肠球菌、铜绿假单胞菌、结核杆菌等。多需由细菌培养来确认。