浆膜腔积液细胞的染色体分析

第三节 浆膜腔积液细胞的染色体分析

一、胸腹腔积液细胞染色体直接制片法

1．标本收集

常规无菌抽取胸腹腔积液，心包或关节腔积液等8～10ml （加少量38g/L枸橼酸钠或肝素抗凝），立即以800～1000r/min离心沉淀7min，弃去上清。

2．低渗处理

在上述细胞沉淀液中加入0.75mol/L氯化钾低渗溶液处理20min。

3．预固定

在已低渗处理过的细胞悬液中，加入新鲜配制的甲醇—冰醋酸（3∶2）固定液1ml，混匀，离心，弃去上清液。

4．固定

再加入甲醇—冰醋酸固定液5ml混匀，固定15min后，用吸管轻轻翻动混匀，继续固定15min。再用吸管反复混合数次，促使细胞分散（但不宜过重吹打）。离心沉淀，弃去上清液。

5．再固定

重复上述“4”步骤一次，留下细胞悬液0.5ml左右（视细胞量多少而定）。

6．制片

将混悬液滴于洁净玻片上，每片3～4滴，迅速通过火焰烘干。用吉姆萨染色液染10min，水洗晾干后镜检。

二、胸腹腔积液细胞染色体秋水仙素处理法

（1）标本的留取与直接法相同，离心沉淀。

（2）在细胞悬液中加入不含小牛血清的RPMI1640培养液，或平衡盐溶液9.9ml和秋水仙素液（10μg/ml）0.1ml，最终浓度为1μg/ml，置37℃1h。

（3）低渗处理、固定、制片与直接法相同。

三、胸腹腔积液细胞染色体显微镜分析

首先在低倍镜下观察，再用油镜对染色体进行计数和鉴别，并计算出染色体数目，各自所占百分比和记录标志染色体。如果分裂象较少，应多观察几张片子，尤其对细胞形态有明显改变者，应特别仔细检查，以提高检出率。

四、胸腹腔积液细胞染色体结果判断

（1）染色体在46条或无分裂象者，周围细胞（指涂片中的其他细胞）大小较一致，边缘整齐，多为小淋巴细胞，少量正常浆膜细胞或破碎的中性粒细胞，可认为非恶性胸腹腔积液。

（2）染色体在47～70条之间的超二倍在5%左右，未见到多倍体，细胞有轻度改变者，可认为是可疑恶性胸腹腔积液，这时应多次复查。如此种超二倍体达10%以上并可见到多倍体，周围细胞明显大小不一，形态多样，核仁大而清晰，可认为是恶性胸腹腔积液。

（3）染色体在100条以上，细胞形态有明显改变，常呈现团簇分布现象，即使全片仅见到一个多倍体，也可以认为是恶性胸腹腔积液。

判断恶性或非恶性时，凭染色体数目异常即可作出恶性肿瘤的判断。特别是多倍体和超二倍体更为可靠，但亚二倍体较难判断（尤其是在分裂象少的情况下），恶性胸腹腔积液染色体大多在90条以上，但不一定都出现标志染色体。

五、染色体显带染色法

显带染色法是坚定各个染色体及其结构的现代方法，目前常用的显带技术有Q带、C带、R带、T带和高分辨的G带等几种。常规工作多用G显带法，以下着重介绍G带和C带染色法。(https://www.daowen.com)

（一）胰酶处理G带染色法

将制作的标本放在80℃烤箱中烤2h，或60℃烤箱过夜，待其冷却后备用。配制2g/L胰酶生理盐水溶液（用5%碳酸氢钠溶液调到p H7.4），放置水浴中加温至37℃，将冷却后的片子放入上述加温的胰酶中，不断摇动处理16～18s（时间根据各实验室条件而定），取出后立即用姬姆染液染10min，干后即可镜检分析。

（1）好的G带染色体外观整齐，各区带深浅对比显著，各深带着色较深，且彼此分开。如胰酶处理过度，则染色体肿胀甚至界限消失，形成“空壳状”，或虽有带，但较模糊，呈绒毛状。相反，如果处理不够，则染色体与一般姬姆萨染色无异，见不到深浅带。

（2）不同厂牌批号的胰酶其活性有时相差较大，因此所用胰酶的浓度和处理时间各家报道不一，自2.5～25g/L，时间从几秒到几分钟，应根据自己实验室的条件摸索出最合适的浓度及处理时间。浓缩酶液的标本处理时间宜短，稀胰酶则处理时间长。故胰酶之浓度要与不同厂牌规格、处理时间、温度和p H值配合一致，才能得到最佳效果。一般在制片后立即完成效果最好，如标本储存时间越久，则胰酶处理时间越长。

（二）C带染色法

主要是先是染色体中高度重复的DNA区，即结构染色质区。

1．试剂

（1）HCl0.2mol/L。

（2）氢氧化钡饱和溶液50g/L。

（3）2×SSG溶液：氯化钠17.54g，枸橼酸钠8.82g，加蒸馏水至1000ml，p H调至7.0，混匀，4d后使用。

（4）浸入已预温至60～65℃的2×SSG溶液中60～90min，冲洗。

（5）姬姆萨染色10～15min，水洗晾干，镜检。

2．临床经验

着丝粒及Y染色体长臂呈深的颜色，而染色体的其余部分仅显很淡的颜色，如氢氧化钡和2×SSG处理不够时，则其余的染色体均显色，仅较C带略浅；反之，如处理过度，染色体肿胀，着丝粒处仅显浅色。

六、染色体分析常用试剂配制

1．肝素溶液

取静脉注射用的肝素小瓶1支（含12500U），用无菌生理盐水稀释25倍（每毫升含肝素500U），分装小瓶，每瓶0.2ml，灭菌后即可应用，可抗凝5ml全血。

2．秋水仙素溶液

称取秋水仙素10mg溶于100ml生理盐水（或蒸馏水）即为100μg/ml原液，再将原液稀释10倍即成100μg/ml。

3．姬姆萨染色液

称取姬姆萨色素粉末1g，加甘油50ml，纯甲醇50ml，先将粉末置于研钵中，用甘油充分研磨后，置55～60℃水溶液中2h，不断搅动，使其充分溶解。待冷却后加入甲醇混合，以后每日摇动1次，1周后即可使用。使用前取上述原液1份，加M/15磷酸盐缓冲液（p H6.5）9份，每次根据标本实际用量新鲜配制。

4．M/15磷酸盐缓冲液

（1）KH2PO49.08g溶于蒸馏水，加水至1000ml。

（2）Na2HPO4·2H2O11.87g（Na2HPO4·12H2O23.87g）溶于蒸馏水，加水至1000ml。

取①18.2ml与②81.8ml混合，p H7.4。

5．0.075mol/L氯化钾低渗液

称取氯化钾5.6g溶于蒸馏水，加水至1000ml即可。