羊水细胞遗传学检查与应用
第四节 羊水细胞遗传学检查与应用
一、羊水细胞培养及染色体标本的制备
（一）羊水细胞培养操作
（1）一切操作均在严格无菌条件下进行，抽取羊水20～30ml，立即送往实验室。
（2）将穿刺所得羊水离心（800～1000G）5min，尔后在接种箱内吸出上清液留其他检查用，将剩下的0.5ml沉淀在管底的羊水细胞轻轻打匀，分别接种在两个盛有培养液的无菌培养瓶内，充分混匀，塞紧瓶塞，放入37℃培养箱。
（3）培养液多采用F10，L-谷氨酰胺，加小牛血清双抗p H调至6.8，使用1周重新配制。
（4）观察换液，培养5～7d，羊水内有活力的细胞就贴在瓶壁上，并开始生长，可在倒置显微镜下观察生长情况。如细胞已贴壁生长，以后每1～2d在倒置显微镜下观察1次。贴壁细胞的形态大多数为上皮样细胞，换液后成纤维细胞呈大片生长。
（二）羊水细胞培养下的细胞类型
未培养的羊水细胞多呈不规则的鳞状，其中有不少核是固缩的。经过一段时间培养，基本上有两种细胞群，一是成纤维细胞（包括羊水样细胞），另一种是上皮样细胞，此外还能见到一些正处于分裂的圆球形细胞。
上皮样细胞又分为：①密集形上皮样细胞。②镰刀形上皮样细胞。③圆形上皮样细胞等。正确区别各类细胞对于了解细胞生长状况，估计羊水细胞能否培养成功，以及确定细胞收获时间有重要的意义，现分述如下。
1．成纤维细胞（F细胞）
羊水中成纤维细胞在形态、克隆密集和生长潜能上，皆相似于皮肤成纤维细胞。关于这种细胞起源的几种意见：①成纤维样细胞部分来源于母体皮肤细胞，因而对于只见成纤维细胞克隆的原代培养细胞，应小心排除母体细胞污染的可能性。②认为成纤维样细胞是由上皮样细胞演变而来，特别是经过几次传代或细胞长得很密时，皆呈纤维状。成纤维样细胞占优势的培养物，可在适当时候收获，取得染色体标本。
2．上皮样细胞
（1）密集形上皮样细胞（E细胞）。这种细胞呈三角形、多边形或椭圆形，细胞与细胞间紧密相接，细胞克隆与周围培养液有一明显的界线，这种细胞从克隆形态上很易与羊水细胞区分。密集型上皮样细胞生长较缓慢，克隆中不多见圆形分裂细胞，一般也能收到分裂细胞，但频率不高。
（2）镰刀形上皮样细胞。在不良培养基或含有毒性物质的培养液中生长的羊水细胞常呈镰刀形，这类细胞体积大，细胞质疏松，空泡很多，分裂极慢或几乎不分裂。多次换液或传代也很难改变其形态，只要有镰刀样细胞的培养物，肯定不能获得满意的结果。
（3）圆形上皮样细胞。在羊水中有时可见到一类圆形上皮样细胞，其发生机制不明确。出现这类细胞时，不应急于收获，经过几次换液或传代，有时能够使细胞类型发生改变。
3．羊水细胞（AF）
羊水样细胞的形态介于上皮样细胞和成纤维细胞之间的细胞，有的把此类细胞归到成纤维细胞，有的归到上皮细胞。这种细胞常呈多角形，细胞排列不整齐，细胞质呈放射状突出。羊水样细胞在克隆外形、生长潜能和某些生化特征性上与上皮样细胞相似。在羊水样细胞占优势的羊水培养物中，只要选择合适的收获时间，一般均能得到满意的结果。
（三）羊水细胞的收获时间
准备掌握羊水细胞收获时间是羊水细胞培养成功的关键。有以下标志可收获：①培养瓶中有4～6个较大的细胞“克隆”。②细胞“克隆”中存在球形明亮的分裂细胞，有时互相连接，成双成对，能在一个视野中计数10～15个球形细胞。③标记一个视野的细胞数，加入秋水仙素数小时后再计数，若分裂细胞数目加倍，此时便可收获，若分裂细胞不变，可将含有秋水仙素的培养液弃去，加入新鲜培养液继续培养。
（四）染色体标本的制备
（1）一般羊水细胞培养9～15d可以收获制片。
（2）在收获制片前1d换新鲜培养液，使细胞营养充足。
（3）于培养终止前4～6h加入秋水仙素，最终浓度为2～3μg/ml。可抑制纺锤丝的形成，使大部分细胞停止在分裂中期，以增加检查时有丝分裂细胞的数量。
（4）消化。先将培养液倒入离心管内，培养瓶内加入0.02% EDTA胰酶消化液2ml，置37℃恒温箱中5min，后用弯头滴管轻轻吹吸瓶壁，使贴壁而被消化的细胞脱落，将酶解下来的细胞合并到离心管中，再用0.85%Na Cl2ml冲洗瓶内残留细胞一起合并离心管中。离心（300G）6～8min，弃去上清液，留下细胞沉淀0.3～0.5ml。
（5）低渗。离心管内加入预温37℃低渗液（0.4%枸橼酸钠与0.4%KCl1∶14滴，以手轻轻弹管底或气泡冲匀后，低渗液加至1ml，37℃水浴5min，细胞膨胀，使染色体均匀分散）。
（6）固定滴片。加固定液（甲醇∶冰醋酸=3∶1）7滴，轻轻将气泡冲均匀为预固定。离心5min，弃去上清液，加入新鲜配制的固定液4ml，混匀，固定20min，反复固定2～3次，然后用制成的细胞悬液滴在预冷的冰水玻片上，每片1～2滴，立即置于60℃烤箱中过夜或37℃3d。
（7）显带。做G带、C带，根据需要加做Q带、R带。
有很多方法可显示染色体上带纹。由于这些显带技术的出现，能识别过去用普通染色法不能识别的染色体，并能对单个染色体的各区段准确定位，从而大大促进了染色体结构异常的研究与检测，G显带就是许多染色体显带方法之一，也是最常用的。它是染色体标本经胰蛋白酶处理后，用Giemsa染色，使染色体产生浓淡相间的带。每条染色体都有特异性和标志带，机制虽不十分清楚，但它的技术掌握，在细胞遗传学中广泛应用。尤其是胰酶法，方法简单，实用价值大，值得推广。
G显带的具体方法是：①取0.05%胰酶液，放入立式50ml染色缸中，用5%Na HCO3调至p H7.0，放入37℃水浴锅中保温。②Giemsa染液1ml放入染色缸，加入p H6.8磷酸盐缓冲液至50ml，混匀，放入水浴锅中保温（37℃）。③将已烤过且自然冷却的标本浸入预温37℃的胰蛋白酶染色缸中，并不断摇动1min左右取出，立即投入缓冲液中漂洗，以终止消化。④将上述胰酶消化过的染色体标本放入Giemsa染液中，染色约10min，自来水冲洗，干燥，镜下观察，可见深、浅、窄、宽相间的带纹，即为G带。
（五）临床经验
许多因素会影响到G显带标本带条质量。带纹是否清晰可辨，除标本本身的质量和老化程度外，还取决于胰蛋白酶的浓度、p H值、温度和作用之间的搭配。
（1）胰蛋白酶的浓度或温度偏高，反应速度快，反之反应速度慢，特别应当注意的是胰酶液配好后，放入37℃水浴锅内15min，使其温度稳定再进行显带。
（2）胰酶p H值一般在7.0～7.2，处理约1min，具体应试片。在镜下观察带纹清晰可辨，细胞色泽紫红，说明胰酶作用时间适当。如果染色体边缘发毛或染色体间连成一片，分不清单条染色体，染色又浅淡，说明胰酶作用时间太长，消化过了头，要调整。
（3）标本的片龄越长，对胰酶处理时增加时间，存放时间太久的分解后往往不会出现带纹或呈不均匀染色。
（4）烤片温度：笔者采用60℃过夜（不超过24h）；37℃烤片72h效果很好，可染出高质量标本，如果温度过高在80℃以上，染色体无带，有时像空了似的，有时呈斑点状染色，无法识别。
（5）染缸的洗涤很重要，清洗后一定用双蒸水充分冲洗，以除去二价阳离子，否则影响显带效果。
（六）染色体核型分析及描述
人类染色体分析、识别是根据“人类染色体命名的国际体制（1978年）”缩写为“ISCN（1978）”，是国际上权威性文献，从而为识别各号码染色体上某一片段的重复、缺失、倒立、易位与疾病的关系提供了可靠的依据。
正常染色体核型 人类染色体总数为46条，常染色体为1～22对，性染色体XX或XY。核型描述，首先是包括性染色体总数，加一个逗号（，），再加性染色体。例如：正常男性核型为46，XY，总数是46条染色体，一条X和一条Y染色体；正常女性核型为46，XX，总数是46条染色体，两条X染色体。
（七）临床意义
（1）羊水细胞染色体检查。可用于胎儿染色体病的产前诊断，如染色体数目或结构异常引起的遗传病。因为这种异常涉及成群基因增减或位置的移动，所以常表现为一种综合征，如多发性畸形、生长迟缓和智力缺陷等，多数导致流产、早产或死产。目前在人类中已发现的染色体异常达3000多种，流产的胚胎约有50%，其中三体又占这些异常的50%，死产婴儿的8‰。
（2）孕妇年龄与羊水染色体检查。生育年龄和染色体异常之间有密切关系，主要指21，18，13三体及47，XXY；47，XXX和47，XYY等。资料提示，40岁后妊娠，后代患染色体风险为3.4%。随着年龄上升，风险急剧上升，45岁时风险＞10%。因此，我国“母婴保健法”和国外高龄孕妇时产前诊断指征，一般认为，35岁或37岁以上孕妇为高龄孕妇。但父亲年龄效应资料表明，21-三体额外的染色体有1/4起源于父亲，在Down综合征发生率中，父亲年龄效应也是存在的，且父亲年龄＞55岁，效应更为明显。
（3）易位携带者。在实际病例中观察，易位比孕妇年龄导致后代染色体缺陷的可能性更大一些，当双亲之一是染色体易位携带者时，风险大小因易位性质不同而不同。一般认为，母亲如为是易位携带者时，其风险要比父亲为易位时大，包括罗伯逊易位和相互易位、倒位、缺失、超数染色体，以及其他不平衡易位结构，大约占活产儿的1/161。平衡易位携带者导致后代患有染色体缺陷主要是指Down综合征的再发风险，易位型的Down综合征是产前诊断（羊水绒毛）碰到的一种常见形式。
（4）生育过21-三体综合征患儿的孕妇，年龄在25岁以下，再发风险可增加50倍。如再次妊娠，应做产前羊水（绒毛）染色体检查。
（5）环境影响。孕妇受环境因素影响有可能使胎儿发生染色体异常。在妊娠的前3个月胚胎形成期如有下列情况之一者，均建议做（羊水绒毛）染色体检查。①放射线接触史。②曾服用某些药物。③病毒等病原体感染。
如果在产前检查中发现胎儿染色体异常，可及时终止妊娠，避免患儿出生，达到优生目的。
二、羊水细胞性染色质检测
性染色质与X、Y染色体是同一物质在细胞不同时期的两种形态结构。它们之间在数目和结构上都有十分密切的联系，性染色体要在细胞核分裂中期才能见到，况且还需要进行细胞培养、制片、染色体分析等一系列繁杂的手续，而性染色质在间期核中就能见到，只要能收集到没有蜕变的细胞，就可直接涂片染色检查。以前在法医、妇产科、泌尿科、生物学已广泛应用。为了测定胎儿有无性连锁遗传性疾病，可以检查来自羊水细胞的性染色质，以测定胎儿的性别，以便进一步采取措施。对因性染色体数目异常所致的性畸形胎儿，性染色质检查也是一种简单而有效的能够提供进一步做染色体分析的初筛手段。
（一）羊水细胞X染色质的测定
1．X染色质的形态特征
X染色质在核内的位置有三种，最常见的是位于核膜内，常呈平凹形或三角形，有时呈圆盘形，好似核膜增厚。第二种情况，X染色质在神经细胞内，靠近核仁，呈圆形。第三种情况，有时X染色质在核内呈游离状态，为圆形或椭圆形小体。后两种与常染色质难以区分，因此笔者在计数X染色质时制定了X染色质的判断标准：染色质的位置在核膜内侧；紧贴核膜、浓染、致密；形态为半月形、三角形或哑铃形等；直径为1.0～1.5μm。(https://www.daowen.com)
2．检查分析方法
用甲苯胺蓝染色。羊水中的细胞大多数为衰老的脱落细胞，可计数细胞的条件是：细胞核着色均匀，核膜完整，轮廓清楚，无缺损和皱褶，染色清晰，核质呈细网状或均匀的细颗粒状，无杂质等污染。记录这类典型细胞100个，观察X染色质的出现率。
3．X染色质的出现率
凡含有X染色质的细胞核，均为X染色质阳性核；反之，凡不含有X染色质的细胞，均为X染色质阴性核。在女性细胞中， X染色质的阳性率可为20%～96%，在男性细胞中基本不存在。文献报道女胎羊水细胞X染色质阳性核的出现率为5%以上。
4．X染色质的来源
X染色质来源于一个失活了的X染色体。女性体细胞中含有XX，在胚胎发育的早期（第16d），这两条X染色体中的一条染色体随机体的形成兼性染色质状态发生遗传学失活，即不进行转录，但仍能复制。失活的X染色体在间期核内呈异固缩状态。该失活的X染色体可以来自父亲，也可以来自母亲，机会相等。不论人体细胞内有几条X染色体，只有一条X染色体是有遗传活性的，其余的都因失活而异固缩形成X染色质。因此，X染色质的数目为X染色体数减一个。
5．染色质和X染色体的关系及结果判断
X染色质的形状、大小和数目与X染色体正常与否有着密切的关系。
（1）X染色质体积小于正常。①X染色体臂缺失。②一条X染色体为环状染色体。③一条X染色体为短臂、等臂染色体。
（2）X染色质体积大于正常。①一条X染色体为长臂、等臂染色体。②一条X染色体为X染色体末端重排，这条染色体是两条X染色体，均是从长臂末端X928处分裂后，两条染色体重接后形成，几乎比X染色体大了1倍，因此，从形态上增大了，形状呈哑铃形。
（3）X染色质缺如：①正常男性。②男性假两性畸形和少数真两性畸形。③X单体综合征。
（4）1个X染色质。①正常女性。②女性假两性畸形和多数真两性畸形（46，XX）。③具有47，XXY，48，XXYY核型者均出现一个X染色质。
（5）2个染色质。①如果性染色体为XXX者，则出现两个X染色质。②如核型内性染色体XXXY或XXXYY出现两个X染色质。
（6）3个或4个X染色质。①1985年河北省医院发现1例49，XXXYY，其X染色质检查是3个染色质。②凡具有5条X染色体的个体，X染色质检查就有4个X染色质。
（二）羊水细胞Y染色质的测定
1970年Pearson等发现，在男性口腔黏膜上皮细胞分裂间期的细胞内，用荧光染剂料（如二盐酸喹吖因）染色后，可看到一个直径约0.3μm的强荧光体，以后Barlo和Vasa用喹吖因精子，发现39%～40%的精子有显著的荧光点，这种荧光小体与Y染色体有关，故命名为Y小体（Y染色质），而在女性胎儿羊水细胞中见不到类似的荧光小体。
1．Y染色质的形态特征
在荧光显微镜下，用阿的平等药物染色后，Y染色质呈现一个亮黄色的圆形或卵圆形的小亮点，直径为0.25～0.3μm，它在核的位置有多种。位于细胞核边缘者占31.5%，位于核中心者占27.8%，位于核近中心者39.8%。
2．Y染色质的出现率
常规检查Y染色质的口腔黏膜上皮细胞内，Y染色质呈阳性核的出现率，男性为25%～50%。男胎羊水细胞Y染色质阳性核的出现率为30%～60%。女胎羊水细胞不见Y染色质。
3．Y染色质的来源
Y染色质是男性细胞核所特有的，它是Y染色体长臂远端的异染色质部分。其根据如下：
（1）在有丝分裂中期，Y染色质的荧光较其他染色体的荧光强，因而在间期核内发强荧光部分（Y染色质）应为Y染色质的表现。
（2）Y染色质和Y染色体长臂远端部分荧光染色反应一致，大小相似。
（3）在同一个体内，细胞核的Y染色质和Y染色体的数目相等，正常男性有一个，正常女性无。
（4）具有Y染色质的精子的比例，相当于减数分裂后含Y染色体的精子的比例。因此，不含Y染色质的精子就是不含Y染色体的精子，也就是只含X染色体的精子。
（5）在具有一个异常大Y染色体的细胞，在间期核内Y染色质也大。总之，有一个Y染色体就表明此细胞内只有一个Y染色质。
4．Y染色质和Y染色体的关系
Y染色质的数目和大小与Y染色体正常与否有着密切关系。
（1）Y染色质缺如。凡属下列情况之一者不易见到：①正常女性。②X-单体综合征和Y-三体综合征。③女假两性畸形和多数真两性畸形。④XX男性。⑤男性小Y染色体。
（2）一个Y染色质。凡属于下列情况之一者，一个间期细胞核内有一个染色质：①正常男性。②XXY综合征（因为仅有一个Y染色体，所以只能见到一个Y染色质）。③男性假两性畸形和少数真两性畸形患者。
（3）两个Y染色质。凡属下列情况之一者，一个间期核内可有两个Y染色质：①XYY综合征。②具有48，XXYY和49， XXXYY的胎儿。
三、羊水细胞脆性X综合征的产前诊断
羊水细胞培养脆性X染色检查。
1．羊水细胞培养
用TC199培养基加用Fudr和咖啡因双诱导，在终止前需秋水仙胺处理，一般来说可提高脆性X染色体的检出率。
2．脆性X染色体诊断标准
①在G显带标本上确认脆性X染色体和计数脆性X染色体的阳性率。②发现3个或至少2个脆性X染色体阳性细胞，可诊断为阳性。③关于脆性X染色体核型的描述，可采用下述写法：
46，XY，未见脆性X染色体（O/N计数细胞数）。
46，XX，未见脆性X染色体（O/N）。
46，X，fra（X），Y，脆性X染色体阳性（阳性细胞数/N）。
46，X，fra（X），脆性X染色体阳性（阳性细胞数/N）。
四、羊水细胞高分辨染色体检查
1．原理
培养羊水细胞群中的细胞，各自处于细胞周期的不同阶段，为了获得较多的早期染色体，最好的方法是让培养的细胞同时分裂，即称为细胞同步化。它的原理是使细胞内DNA合成暂时阻断，如过量的胸苷可以形成多量的三磷腺苷。因此能反馈性地抑制胸腺嘧啶核苷合成酶，从而使DNA复制减慢，使细胞被阻止在DNA合成期，或以极慢速度通过DNA合成期。当解除阻断后，细胞即可迅速恢复DNA合成，进入分裂期，形成分裂高峰，即可获得较多的早期分裂细胞，再加入Budr掺入DNA分子中取代脱氧胸腺嘧啶核苷，干扰DNA分子的四级结构，降低其螺旋化程度，产生染色体伸长的效果。
2．操作步骤
取羊水的时间、接种、培养处理普通染色体检查。只是在羊水培养8～14d时，细胞生长的克隆进入旺盛期（有6个克隆时，每个克隆的密度适宜），换液，留原培养液1ml，加入新鲜的含30%小牛血清F10培养液3ml，继续培养1～3d，有较多圆形细胞出现。再加入胸腺嘧啶核苷，最终浓度为0.4～0.5mg/ml，继续培养14～18h；用p H6.9的F10培养液洗脱2次，然后加入含有小牛血清的F10培养液4ml，置37℃培养10h左右，可见很多大圆形细胞时，加入放线菌素D（最终浓度为0.5～2μg/ml），处理1h，收获前20～30min再加秋水仙素，浓度为0.5μg/ml。常规制片，分析。
3．临床经验
①羊水细胞内有活力的细胞少，比较娇嫩，不易培养，高分辨染色体相对少些，因此要想得到良好的羊水细胞高分辨染色体，要掌握好同步时间。②为制备出分散良好的羊水细胞高分辨染色体标本，固定次数和时间可增多或延长。
4．临床意义
①可对染色体微小片段异常检出。②可发现新的染色体综合征或异常。③已知染色体病的准确定位。④表型和基因在染色体上的定位。⑤纠正一般显带的错误和补充。在产前诊断研究中有重要价值。