7.1 体内过表达Myc可抑制JNK诱导的肿瘤细胞侵袭
为了验证癌基因Myc是否参与了肿瘤细胞侵袭与迁移的调控，我们首先检测了在lgl-Ras的基础上过表达Myc对肿瘤细胞侵袭的影响。过表达RFP（红色荧光蛋白）不会对lgl-Ras细胞侵袭表型造成影响（图7-1 B′，I），而我们惊奇地发现过表达d Myc非但没有增强，反而很好地抑制了肿瘤细胞向腹部神经节（VNC）的侵袭（图7-1 E′，I），而肿瘤大小并无显著性的变化（图7-1 E）。而过表达另外一个已知的癌基因Yki却不能抑制lgl-Ras的侵袭表型（图7-1 C′，I），证明Myc这一癌基因对于抑制肿瘤细胞侵袭的特异性。研究发现Myc能与Max（MYC-associated protein X）形成异源二聚体复合物进而结合在DNA上调控基因的转录[140]。于是我们猜想是否Max也参与了果蝇体内肿瘤细胞侵袭的调控。
我们发现单独过表达Max不能抑制侵袭表型（图7-1 D′，I），但在表达d Myc的同时过表达d Max则可以完全抑制lgl-Ras向VNC的侵袭（图7-1 F′，I），表明d Max也参与了抑制肿瘤细胞侵袭的调控。鉴于Myc蛋白在进化上的高度保守性，我们接下来检测了过表达人类同源蛋白c Myc对lgl-Ras肿瘤细胞侵袭的影响。结果显示过表达c Myc1也能够显著性地降低肿瘤细胞向VNC的侵袭（图7-1 G′，I），同时过表达c Myc1与d Max同样完全抑制了lgl-Ras的侵袭表型（图7-1 H′，I）。
图7-1 Myc过表达抑制lgl-Ras及Hep-Ras协同作用诱导的肿瘤细胞迁移（见彩图12）
（A—H）荧光显微镜3龄幼虫眼成虫盘及腹部神经节（VNC）图片，GFP标记克隆。Ras V12/lgl-/-诱导的肿瘤细胞侵袭（A′）不会被过表达RFP（B′），YkiS168A（C′）或d Max（D′）抑制，可以被过表达d Myc（E′），d Myc和d Max（F′），c Myc1（G′）或c Myc1和d Max（H′）所抑制。（I）A′—H′肿瘤细胞迁移统计数据。
（J—N）荧光显微镜3龄幼虫腹部神经节MMP1抗体染色图片，GFP标记迁移的肿瘤细胞。Ras V12/lgl-/-诱导的MMP1激活（J′）不会被过表达LacZ（K′）或d Max（L′）抑制，可以被过表达d Myc（M′），d Myc和d Max（N′）抑制。
（O—S）荧光显微镜3龄幼虫眼成虫盘p-JNK抗体染色图片，GFP标记迁移的肿瘤细胞。Ras V12/lgl-/-诱导的JNK磷酸化上调（J′）不会被过表达LacZ（K′）或d Max（L′）抑制，可以被过表达d Myc（M′），d Myc和d Max（N′）抑制。（T—U）荧光显微镜3龄幼虫眼成虫盘（T，U）及VNC抗体染色（T′，U′）图片。Ras V12/Hep WT诱导的肿瘤细胞迁移及MMP1激活（T′）可以被过表达c Myc1和d Max（U′）抑制。（X）T′—U′肿瘤细胞迁移统计数据。P值由t检验算出，表示平均值+S.D.，n＞10，（***P＜0.001）。
（A，J，O）y w，ey-Flp/+；tub-Gal80，FRT40A/lgl4FRT40A UAS-Ras V12；Act＞y+＞Gal4，UAS-GFP/+。（B）y w，ey-Flp/+；tub-Gal80，FRT40A/lgl4FRT40A UAS-Ras V12；Act＞y+＞Gal4，UAS-GFP/UAS-RFP（K，P）y w，ey-Flp/+；tub-Gal80，FRT40A/lgl4FRT40A UAS-Ras V12；Act＞y+＞Gal4，UASGFP/UAS-LacZ（C）y w，ey-Flp/+；tub-Gal80，FRT40 A/lgl4FRT40 A UAS-Ras V12；Act＞y+＞Gal4，UAS-GFP/UAS-YkiS168A（D，L，Q）y w，ey-Flp/+；tub-Gal80，FRT40A/lgl4FRT40A UAS-RasV12；Act＞y+＞Gal4，UAS-GFP/UAS-d Max（E，M，R）y w，ey-Flp/+；tub-Gal80，FRT40A/lgl4FRT40 A UAS-Ras V12；Act＞y+＞Gal4，UAS-GFP/UAS-d Myc（F，N，S）y w，ey-Flp/+；tub-Gal80，FRT40A/lgl4FRT40A UAS-Ras V12；Act＞y+＞Gal4，UAS-GFP/UAS-d Myc，UAS-d Max（G）y w，ey-Flp/+；tub-Gal80，FRT40 A/lgl4FRT40 A UAS-Ras V12；Act＞y+＞Gal4，UAS-GFP/UAS-c Myc1（H）y w，ey-Flp/+；tub-Gal80，FRT40 A/lgl4FRT40A UAS-Ras V12；Act＞y+＞Gal4，UAS-GFP/UAS-c Myc1，UAS-d Max（T）ey-Flp，Act＞y+＞Gal4，UAS-GFP/UAS-Hep WT；UAS-Ras V12/+（U）ey-Flp，Act＞y+＞Gal4，UAS-GFP/UAS-Hep WT；UAS-Ras V12/UAS-c Myc1，UAS-d Max。(https://www.daowen.com)
研究发现lgl-Ras肿瘤细胞之所以有很强的侵袭能力是因为这些细胞中MMP1的表达量很高[70，126]，而MMP1上调可以降解基膜（basement membrane）从而促果蝇体内进侵袭与迁移的发生。与我们之前结果相符的是，lgl-Ras腹部神经节中MMP1的激活不会因d Max过表达所影响，却可以被过表达d Myc或同时过表达d Myc与d Max所抑制（图7-1 J—N），表明Myc能够通过抑制MMP1的激活，从而影响了肿瘤细胞的侵袭。
而MMP1除了能够直接影响迁移发生外，也是JNK信号通路下游的报告基因[126]，提示我们Myc有可能通过干扰JNK信号通路的活化进而抑制细胞迁移。于是我们直接检测了JNK磷酸化水平的改变。与之前研究结果相符[17]，lgl-Ras眼成虫盘中的JNK磷酸化水平上升（图7-1 O′）可以被过表达d Myc与d Max显著性降低（图7-1 S′），证明Myc过表达能够抑制JNK通路的活化。
RasV12除了能与细胞极性基因突变协同作用外，还可与过表达JNK信号通路成员（如Hep，Rho1，Rac1）共同诱导肿瘤发生及迁移[41，126]。同样的，我们发现过表达Hep WT能与RasV12一起诱导肿瘤生成，向VNC产生迁移表型并伴随MMP1的激活（图7-1 T）。这种迁移同样可以被过表达c Myc1与d Max部分抑制（图7-1 U，X）。
综合以上实验结果，我们发现Myc过表达抑制了果蝇体内lgl-Ras及Hep-Ras协同作用诱导的肿瘤细胞侵袭，其可能的机制是通过抑制JNK信号通路的活化。