8.5　Yki直接调控Rho1的转录

为了进一步探究Hippo-Yki信号调控Rho-JNK信号通路的分子机制，我们首先用qRT-PCR及Western印迹方法检测Yki过表达对Rho1的影响，结果显示在翅成虫盘中用ptc-Gal4过表达YkiS168A就足以上调Rho1 m RNA以及蛋白水平（图8-7 K，L）。为了进一步证实YkiS168A能够激活Rho1转录，我们又用原位杂交的方法进行了检测，发现过表达YkiS168A可以在翅成虫盘及唾液腺中激活Rho1的转录，并且这种激活也依赖于Sd（图8-7 A—C，F—G）。

Sd能够结合在CATTCCA这一特异性序列进而激活下游基因的转录[72]，我们对Rho1的顺势调控区域进行检测后发现在Rho1第一个内含子中存在一个与该序列完全匹配的片段（图8-7 M）。为了验证这个片段是否为真的Sd结合位点，我们将该内含子一分为二，分别连入到荧光素酶报告载体中，一段含有内含子的前半部分（E1），另一段含有该内含子的后半部分（E2），其中包括我们预测的Sd结合位点（图8-7 M）。然后我们将这两个载体分别与Yki在果蝇S2细胞中进行瞬时转染，与我们预测相同的是，只有E2片段在转染Yki后显示出很强的荧光素酶转录活性，而E1片段却不能激活（图8-7 N）。我们进一步的实验表明在此基础上敲除预测的Sd结合位点（E3）能够显著性地降低E2片段的转录活性（图8-7 N），表明这一CATTCCA序列很有可能是真的Sd结合位点。

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图8-7　Yki/Sd复合物直接转录Rho1

（A—J）光学显微镜3龄幼虫翅成虫盘或唾液腺原位杂交染色图片。过表达YkiS168A（B，G，ptc-Gal4 UAS-GFP/+；UAS-YkiS168A/+）或者Yap S127A（D，I，ptc-Gal4 UAS-GFP/+；UAS-Yap S127A/tub-Gal80ts）激活的Rho1转录能被下调sd所抑制（C，H，ptc-Gal4 UAS-GFP/UAS-sd.RNAi；UAS-YkiS168A/+。E，J，ptc-Gal4 UAS-GFP/UAS-sd.RNAi；UAS-Yap S127A/tub-Gal80ts）。（K—L）过表达YkiS168A能够激活Rho1 mRNA转录（K）并提高Rho1蛋白水平（L）。P值由t检验算出，表示平均值+S.D.，n=3，（***P＜0.001）。（M）包含第一个intron的部分Rho1基因座示意图。Sd的结合位点（CATTCCA）被标出，E1，E2，E3用于驱动荧光素酶表达，A和B表示ChIP试验中的对照及潜在靶向区域。（N）在果蝇S2细胞中进行的双荧光素酶报告实验。P值由t检验算出，表示平均值+S.D.，n=3，（**P＜0.01）。（O—P）在果蝇S2细胞中共转Sd与HA-Yki后进行ChIP-PCR实验，结果显示HA-Yki及Sd都能富集在潜在结合位点，结果显示平均值+S.D.，n=3。

为了进一步验证Yki-Sd复合物能够直接与该位点结合，我们在S2细胞中共转了HA-Yki及Sd后进行了染色体免疫共沉淀实验（ChIP）。用HA及Sd抗体来免疫沉淀与Sd相互作用的DNA片段，然后分别在Rho1基因内含子中跨预测结合位点及转录起始位点上游阴性对照区设计两对PCR引物，以免疫沉淀下来的DNA片段为模板进行q-RT PCR。结果显示HA及Sd能够与片段A结合，却不会与片段B结合（图8-7 M，O，P）。以上实验结果证明Yki-Sd复合物能够结合在Rho1内含子中的Sd结合位点进而对Rho1直接进行转录调控。