第一节 概 述
1 分子流行病学的产生
1.1 耐药性菌株的出现及新的病原微生物
耐药性菌株的出现主要是由于抗生素的大量使用引起的。近年来发现，在传染病的防制中，由于环境及生物体本身的原因，病原体的多变性日益普遍。2001年以来，先后发生了炭疽芽孢恐怖事件、重症急性呼吸综合征（SARS）、甲型H1N1流感、德国肠出血性大肠杆菌O104：H4、H7N9禽流感等重大疫情。一些病毒的变异性较大，极易出现异源或同源重组形成新型病毒，例如SARS。在追踪传染源、确定传播途径、阐明流行规律及疾病防制等方面，应用传统的生物学、血清学等方法常常难以获得令人满意的结果。如何准确检测耐药性病原菌，并确定其分布特征、传播规律和影响因素，进而制定预防控制措施，成为亟待解决的重要课题。传统的应对方案就是对病原微生物进行药敏试验、生化免疫试验以及各种分子分型分析。应用这些方法在一定程度上能指导临床治疗和疫情防控，但很难对疫情做出迅速反应，而且有限的分辨率不能准确区分病原体，因此无法制定针对性强的治疗及防控措施。尤其是面对新发、突发传染病病原或者难以在实验室里培养的微生物，传统分子流行病学方法难以发挥效应，因此不能阻止疫情的继续蔓延。
1.2 宿主易感性差别明显
个体对疾病都存在一定的感受性，即易感性。近年的大量研究特别是全基因组关联研究表明，不同个体或群体之间对传染病的易感性存在较大差异，即使是对新发传染病，不同个体可能也会表现不同。可以通过测定机体内是否存在某种特异性保护抗体的方法来了解其对某种传染病是否具有易感性或免疫力。这种传统流行病学方法在确定这些差异及其在发病中的意义方面常显得办法不多。例如，在伦敦西北区三所医院的结核病调查发现，非洲裔黑人病例比白种人多3倍，而两人群间在性别、出生地、既往治疗史方面都无统计学差异。这表明在特定的局部流行社区，结核病在不同种族间的分布存在差异，不同种族的个体对疾病的易感性是不同的。
1.3 分子生物学技术的发展和应用
学科分化、交叉和融合是学科发展的基本规律。近年来，分子生物学、分子遗传学、生物与化学分析技术发展迅猛，已被广泛应用于人类疾病的研究和实践工作中，极大地提高和加深了人们对疾病本质的认识。传染病流行病学旨在研究人群中传染病的发生、发展和传播规律，探讨影响传染病流行的因素，提出并评价预防和控制传染病流行的策略和措施，从而有效地控制和消灭传染病。随着研究的发展与深入，人们逐渐发现在传染病研究中常用的病原体分离、形态观察、血清反应、生化反应、组织培养、动物反应等方法研究的都是病原体的表型特征，极易受环境因素的影响。分子生物学则旨在分析病原体的基因型特征。基因型特征即遗传特征，它相当稳定，是鉴定和诊断的重要依据。传染病流行病学不断利用分子生物学的新理论、新技术、新方法，从分子或基因水平上研究传染病在人群中的分布和影响因素，从而预防和控制传染病的发生。综合应用多种分子生物学标志，深入研究传染性疾病的分布特征及其流行规律，揭示疾病流行或暴发事件中病例与病例间、病例与密切接触者间、病例与媒介动物间的内在联系，在分子乃至在基因水平直接阐明传染源、传播途径，确定人群易感性以及对各种基因疫苗进行研制和考核已成为国内传染病分子流行病学研究的趋势。
传染病分子流行病学应用先进的技术测量生物学标志的分布情况，结合流行病学现场研究方法，从分子或基因水平阐明疾病的病因及其相关的致病过程。因此，若借助分子生物学技术，在疾病的发生发展过程中，以一系列疾病发生、发展的中间结果而不仅仅以发病结局为测量指标，来研究它们的分布和影响因素，将极大地增加流行病学在传染病防控方面的效能。
2 分子流行病学的发展
2.1 概念的提出及演变
分子流行病学的概念已产生多年，目前正处于快速发展的阶段。早在1972年，Kilbourne在学术报告中首次应用“流感分子流行病学”这一术语，探讨流感病毒变异与流感流行的关系。1977年，法国学者Higginson认为，分子流行病学是应用精细技术进行生物材料的流行病学研究。随后，分子流行病学逐渐被用于各种疾病的研究。但由于受当时分子生物学技术的限制，并没有取得很大的进展。
20世纪80年代后，分子生物学技术发展迅速，新的分子生物学技术也逐渐被应用到流行病研究中。1986年，国外学者明确了分子流行病学的核心，即把先进的实验室方法和分析流行病学结合起来，从而查明环境和（或）宿主病因。在1996年第14届国际流行病学学术会议上，Saracci提出，分子流行病学研究从狭义上讲是测量作为暴露或效应的生物标志——信息大分子，如DNA、RNA和蛋白质。这些概念的发展都极大地丰富了分子流行病学的内涵，扩大了它的研究领域。
2.2 我国分子流行病学的发展
我国从20世纪80年代初开始进行分子流行病学研究，主要是传染病，如对轮状病毒腹泻、大肠埃希菌腹泻等的分子流行病学研究。那时有学者认为，分子流行病学是将分子生物学理论和技术应用于流行病学研究的边缘学科，研究领域主要是通过对造成某一流行的病原体在基因水平分析其特征，从而更准确地解决传染源和传播途径以及有关流行病学问题。20世纪90年代，我国分子流行病学研究尚不广泛，有关文献发表数量年均不超过10篇。此后，有学者提出，分子流行病学是利用分子生物学原理和技术，从分子乃至基因水平研究医学事件在人群和其他生物中的分布及其决定因素与调控手段的学科，将分子流行病学的研究对象从人群扩展到人群和其他生物群体，研究内容从传染病扩展到医学相关事件，包括传染病、慢性非传染病等。1997年，第四届中华预防医学会流行病学分会首次设立分子流行病学学组，次年召开了第一次全国分子流行病学学术会议，推动了国内分子流行病学的发展。分子流行病学从20世纪90年代初期开始逐渐引入我国流行病学的教学中，1998年由第四军医大学主编出版了国内首部《分子流行病学》专著。1999年和2001年分别由北京医科大学和天津医科大学主编出版的供预防医学专业和临床医学专业本科生用的《流行病学》统编教材也相继纳入了分子流行病学章节。20世纪90年代中期之后，我国分子流行病学的研究论文发表数量每年几乎成倍数增长。
2.3 分子流行病学的发展
根据分子流行病学的发展现状和预防疾病、促进健康的要求，目前对分子流行病学的定义为：“分子流行病学是阐明疾病和健康状态相关生物标志（或分子事件）在人群和生物群体中的分布及其影响因素，并研究预防疾病、促进健康的策略与措施的科学。”近年来，随着生物技术的迅猛发展，分子流行病学的研究内容更加丰富，研究手段越来越多，应用范围不断扩大。随着分子流行病学的快速发展，其应用范围不仅仅局限于对传染病的研究，已应用于整个预防医学，而且目前逐渐被应用于基础医学、临床医学、生物学、环境科学和人类学等研究中。
人类基因组计划（human genome project，HGP）的开展极大地推动了分子流行病学的发展。一门新的流行病学分支——人类基因组流行病学（human genome epidemiology，HuGE）应运而生。人类基因组流行病学应用流行病学与基因组信息相结合的研究方法，开展以人群为基础的研究，评价基因组信息对人群健康和疾病的流行病学意义，是遗传流行病学与分子流行病学交叉的前沿领域。基因组流行病学探讨基因组改变对人类健康和疾病危险度的影响，并定量研究各遗传因素间及遗传因素与非遗传因素之间的交互作用，为疾病的预防、（早期）诊断及治疗提供理论依据。
近年来，基因组学检测技术得到了快速发展，基因检测芯片技术和高通量测序技术使得研究者可以在全基因组范围内检测几十万甚至几百万个变异，从而快速筛查基因组遗传变异与疾病（或其他性状）的相关性，达到定位疾病易感基因的目的。这种研究成为全基因组关联研究（genome-wide association study，GWAS），是目前分子流行病学研究中最高效的方法。从2005年开始，全基因组关联研究已经发表2 500多项，定位了数百种表型相关的数千个位点。除此以外，目前应用于分子流行病学研究的检测方法还有很多。例如，采用先进的生物芯片技术和质谱技术可以检测生物大分子（如核酸、蛋白质和酶等），而且这些技术不断地朝方便、快捷方向发展。又如，利用基因芯片技术可以在数分钟至数小时内完成传统分子生物学花数月才能完成的几万次甚至几十万次的基因分析实验。此外，免疫性、细胞生物学、遗传学、生物化学、分析化学和生理学等技术也被广泛应用于分子流行病学研究中。
3 与传统流行病学的比较
分子流行病学与传统流行病学是一个统一体，但又各具不同特征（图12-1）。
图12-1 传统流行病学与分子流行病学的关系（EDC模型）
传统流行病学在研究暴露与疾病或健康状态的关系时，常常使用“黑箱”理论，即直接研究暴露与最终结局的关系。虽然对发病和死亡的测量可以直接反映人群疾病和健康状况，但由于“黑箱”的存在，暴露与疾病或健康状态的关系判断显得缺乏直接证据。分子流行病学则根据健康-疾病连续带（hea l t h-d i seasecon t inuum，HDC）和暴露-发病连续带（exposuredisease continuum，EDC）的原理，通过对疾病或健康不同阶段生物标志物的分布测量及影响因素进行研究，全面阐明疾病自然史及其影响因素，从而揭示“黑箱”秘密，制定更有效的防制疾病、促进健康的策略和措施，并评价其效果。
可见，分子流行病学与传统流行病学相比，研究水平不同，所解决的问题也不同。另外，与分子生物学相比，研究对象不同，研究思维、方法和方向也不同。分子生物学的研究属于微观层面，而分子流行病学是宏观与微观的结合。
需要注意的是，分子流行病学不是一门独立的学科，是传统流行病学研究的发展和深入。分子流行病学虽然应用了许多先进的分子生物学技术，能比较客观、深入地了解疾病的发生发展规律，但从课题设计到资料分析仍以传统流行病学的研究方法为基础。此外，需要注意分子流行病学与遗传流行病学的区别与联系，遗传流行病学是研究与遗传有关的疾病在人群中的分布、病因以及制定预防和控制对策的学科。当采用传统病例对照研究方法对复杂疾病进行研究时，遗传流行病学与分子流行病学所采用的研究技术和分析方法基本一致。
4 分子流行病学研究的主要内容
4.1 生物标志的概念
生物标志物（biomarkers）是对正常生理过程、病理过程或者治疗中的药物反应具有客观度量和评估的生物指标，是指能代表生物结构和功能的可识别物质、分子事件或生物大分子特征。有价值的生物标志物能够揭示具体的生物特征，或者可以在病理或疾病状态下产生可以检测的变化，因此它们往往是DNA（SNP）、RNA（miRNA，lncRNA，circRNA）、表观、外泌体或抗原、抗体、蛋白质（酶）这些主要的功能元件。分子流行病学中的生物标志主要包括三类：暴露生物标志（exposure biomarker）、效应生物标志（effect biomarker）和易感生物标志（susceptibility biomarker）。
（1）暴露生物标志
与疾病或健康状态有关的暴露因素的生物标志被称为暴露生物标志，它包括外暴露标志和内暴露标志。外暴露标志是指进入机体之前的标志和剂量，如病毒、细菌、生物毒素、吸烟烟雾、环境物质等。内暴露标志是相对外暴露标志而言，是指进入机体之后的标志，如生物病原体本身及其代谢产物、产生的毒素等。
（2）效应生物标志
效应生物标志是指宿主暴露后产生功能性或结构性变化的生物标志，如突变的基因、基因表达异常和代谢异常、畸变的染色体、酶学的改变、血液生化（免疫）指标的变化、病原体基因的整合、特异蛋白等。效应生物标志包括疾病标志（disease marker）和健康状态标志（health marker）。(https://www.daowen.com)
（3）易感生物标志
易感生物标志是指在暴露因素作用下宿主对疾病发生、发展易感程度的生物标志。遗传与非遗传因素如年龄、健康状况、饮食等都可能影响个体对疾病的易感性。目前，疾病易感性研究主要关注遗传易感性，即由个体遗传背景差异所导致的不同个体对同一疾病易感程度或治疗反应的强弱。易感性主要与宿主的遗传特征，以及生长发育、营养、免疫、机体活动状态等有关。例如，对SARS易感性的分子流行病学研究发现，2′，5′-寡腺苷酸合成酶（OAS1）的AA基因型及黏病毒抗性蛋白（MxA）的GT基因型与SARS的易感性显著相关。在疾病的不同阶段，宿主可以有不同的易感标志。
生物标志的分类不是绝对的，应根据具体情况而定。就某一生物标志而言，概念是相对的，某一种分子既可以是效应标志，也可以是暴露标志。
4.2 暴露生物标志测量
（1）外暴露标志
外暴露标志主要指环境因素暴露，包括生物性因素和非生物性因素。外暴露研究主要包括以下四个方面：
①生物性病原因子的鉴定。在传染病中，首要任务是准确查明病原体。因此，对病原微生物的分型、分类和检测、鉴定是分子流行病学的重要使命。
②病原微生物进化与变异规律研究。研究病原生物群体遗传关系和进化变异规律（进化树），已成为分子流行病学的重要研究内容。
③确定传播途径。
④环境化学污染物（非生物性因素）暴露。这一类因素的测量主要用于研究慢性非传染性疾病、地方病等，如吸烟烟雾、环境中的有毒元素和化学物质、饮食因素等。
（2）内暴露标志
对传染病进行内暴露测量，可以了解宿主的感染状况，进行抗原抗体检测、病原体基因监测，追踪传染源。对非传染性疾病，检测细胞、组织、血液、体液内生物标志物的含量，可为进一步的生物作用剂量和早期生物效应研究提供直接有力的证据。有人称之为体内剂量（internal dose），如烟草中尼古丁（nicotine）的代谢产物、尿中的可丁宁（cotinine），胃癌的发生与饮食中硝酸盐、亚硝酸盐等的摄入的关系等。内暴露检测对描述感染分布、追溯传染源、确定传播途径、保护易感人群、阐明流行规律等都具有重要价值。
（3）有效暴露标志
有效暴露标志是指已与靶组织细胞内DNA或蛋白质相互作用的外源性物质或其反应产物的含量标志，又称为分子剂量（molecular dose）。例如暴露于苯并芘后，在淋巴细胞中能检测到特异的DNA加成物（adduct）。显然，有效暴露标志是比外暴露标志与内暴露标志更具说服力的剂量标志。
4.3 效应生物标志测量
（1）传染病
传染病效应生物标志测量主要包括免疫效应和病理性效应测量。免疫效应是指病原体感染后可以引起机体的特异和非特异性免疫反应，如抗体产生等。研究人群中某病原体的特异性抗体水平及其影响因素，对阐明传染病的流行规律、制定防制对策和措施、评价防制效果等具有重要意义。病理性效应是指病原体感染可以导致机体产生一定的病理损伤。通过测量机体的这种效应生物标志不仅可以了解感染状态及其影响因素，而且对研究病原体特征和预后判断都是非常重要的。
（2）非传染性疾病
非传染性疾病效应生物标志测量主要集中于基因表达和基因突变方面。在暴露早期或轻度暴露的情况下，宿主不一定有基因突变、组织损伤等明显的改变，但是可以发生基因表达的异常或代谢异常。早期测量可以很好地研究不同暴露因素的作用强度和作用机制。当暴露达到一定程度时，机体就会出现异常的标志物，如恶性肿瘤研究中的抑癌基因或原癌基因等。
4.4 易感生物标志测量
宿主易感性高低在疾病发生、发展和预后中具有重要意义。易感性不仅对于遗传性疾病具有重要意义，而且对于传染性疾病和慢性非传染性疾病来说同样具有意义。在疾病的不同阶段，易感性的意义不相同。
（1）传染病
人们对传染病和寄生虫病的易感性水平高低可以从两个方面进行评判：一是特异性免疫水平，二是对该病原体致病的遗传易感性。第一方面常用血清学生物标志进行评判，如血清中特异性抗体的有无与水平；第二方面则是分子流行病学研究的重要内容之一，可以用基因标志进行评判。例如，慢性丙肝病人中HLA-B44出现频率高达30%以上，对白喉毒素敏感的基因定位在5号染色体长臂，对脊髓灰质炎病毒敏感的基因定位在19号染色体长臂等。
（2）慢性非传染病
环境因素在慢性非传染病发病中具有重要作用，易感因素也是不容忽视的。分子流行病学研究表明，心脑血管病、恶性肿瘤、糖尿病等慢性非传染病都有易感性相关基因标志存在。遗传易感性生物标志是机体稳定存在的遗传性的可测量指标，这种生物标志可以是基因型的改变，如某个基因的缺失、某段未知染色体片段的拷贝数变异（copy number variation，CNV）或者单核苷酸多态性；也可以是功能学或者表型的改变，如代谢表型、DNA修复能力等。随着人类基因组计划及环境基因组计划的完成，越来越多的基因及其多态性被发现，这些基因大多行使机体的日常功能，多态性的改变可能影响其参与的多个生物学途径，如细胞分化、细胞凋亡、细胞周期调控以及DNA修复等，从而导致一系列健康异常状况的出现。目前，遗传易感性研究根据其研究设计的不同特点，可以分为候选基因策略的易感性研究和全基因组关联研究策略的易感性研究。目前使用最为广泛的基因组标志为单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）。SNP是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的在人群中频率超过1%的DNA序列多态性。SNP存在于整个人类基因组中，可能每100～300 bp就存在一个SNP，估计其总数达数千万个。
5 传染病分子流行病学
5.1 概念的提出
分子流行病学最早研究的主要是传染病，如轮状病毒腹泻、大肠埃希菌腹泻等。传染病分子流行病学应用新技术在传染病的预防策略、人群易感性、传播途径、传染源追踪、病因探讨、早期诊断、疫苗研制等方面发挥了重要作用。随着科学技术的进步，分子生物学技术得到了迅猛发展，极大地提高和加深了人们对传染病的认识。传染病流行病学不断利用分子生物学的新理论、新技术、新方法，在分子水平上研究传染病在人群中的分布和影响因素，以期预防和控制传染病的发生。综合应用多种分子生物学标志，深入研究传染病的分布特征及其流行规律，揭示疾病流行或暴发事件中病例与病例间、病例与密切接触者间、病例与媒介动物间的内在联系，在分子水平乃至在基因水平上直接阐明传染源、传播途径，确定人群易感性以及对各种基因疫苗进行研制和考核，已成为国内外传染病分子流行病学的主要研究趋势。
传染病分子流行病学（molecular epidemiology of infectious diseases）是指应用先进的分子生物学技术，研究病原微生物的DNA、RNA分子及蛋白质结构上的差异，研究宿主易感性，阐明传染病的流行病学问题的一门学科。换言之，它主要运用分子生物学技术，与传统的传染病流行病学研究方法相结合，确定传染病的起源、传播、分布、消长和流行规律。例如，病原体的检测分型、变异和流行过程的追踪、传染病的自然史研究以及宿主易感标志物等。
5.2 发展与实践
分子流行病学通过对疾病或健康不同阶段生物标志物的分布测量及影响因素研究，可以全面阐明疾病自然史及其影响因素，揭示“黑箱”秘密，具有巨大的解决问题的能力。将其广泛应用于传染病的防制中，逐步完善并形成传染病分子流行病学，不仅能较好地解决传统流行病学在传染病防制中无法解决的某些问题，而且可使人们更深入地了解疾病发生、发展的过程，从而更有助于控制乃至消灭传染病。
新技术应用于传染病流行病学研究中，多体现在传染病的早期诊断、病因探讨、传染源追踪、传播途径和人群易感性分析、传染病的预防策略研究、疫苗研制等方面，并发挥着越来越重要的作用。近年来由于高通量检测技术的发展，组学研究策略被广泛应用，将传染病分子流行病学研究推向了前所未有的高度。分子流行病学已经被广泛和系统地应用于传染病防制实践中。以结核病为例，最早人们普遍认为，人感染结核分枝杆菌后产生抵抗再次感染的能力，但是后来研究发现，不管是HIV阳性还是阴性的结核病患者，都可能同时感染两种或两种以上的结核菌株。Horn等人报道了3名在门诊及住院期间再次感染耐多药结核分枝杆菌的艾滋病合并结核病患者中，2人死亡。Richardson等报道，HIV阴性结核患者的多重感染率为2.3%。de Viedma等研究发现，在原发性感染中也存在多重感染现象。Chaves等报道，从同一患者痰液和尿液中分离培养的菌株具有不同的基因型。这些都说明多重感染不仅可发生于同一部位，而且可发生在同一患者的不同部位。多重感染现象的存在说明感染结核后机体不能产生有效的免疫力以对抗其他菌株的感染。这一发现对于抗结核免疫研究和疫苗研发都具有重要意义。此外，多重感染现象也对同一病房同时收住多名患者的合理性提出了质疑。