肠道菌感染与疾病
肠道感染最常见的症状是腹泻，可导致感染性腹泻的病原微生物种类繁多，包括细菌、真菌、病毒、寄生虫等。常见致腹泻病原菌包括：沙门菌、志贺菌、致腹泻大肠埃希菌、小肠结肠炎耶尔森菌、霍乱弧菌及其他弧菌、弯曲菌、艰难梭菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌等。此外，有一些少见致病菌，如嗜水气单胞菌、类志贺邻单胞菌等也能导致人类肠道感染。本节主要讨论导致感染性腹泻的常见细菌及其实验室诊断方法，除传统鉴定方法外，PCR检测技术以及MALDI-TOF-MS技术在这些细菌鉴定中也有应用。
（一）沙门菌检验
1. 沙门菌概述
沙门菌属（Salmonella spp）为兼性厌氧、无芽孢、除鸡瘟沙门菌外均有动力的革兰阴性杆菌，是肠杆菌科中最复杂的菌属。沙门菌属体型大多为（0.7～1.5）μm×（2.0～5.0）μm，其无芽孢，是无荚膜的革兰阴性直杆菌，除鸡沙门菌外都有周身鞭毛，能运动，多数有菌毛，有2500多种血清型，其致病性具有种属特异性。沙门菌是食物引起胃肠炎最常见的原因，它可致多种感染，有些种类如伤寒沙门菌等还可引起菌血症。
据世界卫生组织的报告，1985年以来，在世界范围内，由沙门菌引起的已确诊的人类患病人数显著增加，在一些欧洲国家2010年比1985年已增加五倍以上。在我国内陆地区，由沙门菌引起的食物中毒屡居首位。据资料统计，在我国细菌性食物中毒中，70%～80%是由沙门菌引起，而在引起沙门菌中毒的食品中，90%以上是肉类等动物性产品。动物性产品中含有多种丰富的营养成分，非常适宜于沙门菌的生长繁殖，人们一旦摄入了含有大量沙门菌（105/g～106/g）的动物性产品，就会引起细菌性感染，进而在毒素的作用下发生食物中毒。
2.沙门菌属的生物学特性
（1）形态与染色
本属菌为（0.7～1.5）μm×（2.0～5.0）μm、无芽胞、无荚膜的革兰阴性直杆菌。除鸡沙门菌外都有周身鞭毛，能运动，多数有菌毛。
（2）培养特性
营养要求不高，在普通琼脂培养基上即能生长，在液体培养基中呈均匀混浊。在SS琼脂和麦康凯琼脂培养基上35～37 ℃24 h可形成直径约2～4 mm的透明或半透明菌落，对胆盐耐受。产H2S者在SS琼脂上形成黑色中心。
（3）生化反应
除亚利桑那菌外均不能发酵乳糖，大多数IMViC试验为-/+。KIA：K/A、产气+/-、H2S+/-；MIU：动力+、吲哚-、脲酶-。
（4）抗原结构
主要由O抗原和H抗原组成，部分菌株有类似大肠杆菌K抗原的表面抗原，与细菌的毒力有关，故称Vi抗原。
①O抗原
即菌体抗原。沙门菌属的菌体抗原有58种，以阿拉伯数字依次标记。根据沙门菌有共同的O抗原这一特点，分类学者将有共同抗原的细菌归为一组，这就使沙门菌分成42个群（或组），即A、B、C……Z和O16～O67群。每群都有群特异性抗原，如A群O2、B群04、D群O9等。
②H抗原
即鞭毛抗原。H抗原是定型的依据。
沙门菌H抗原有两相：第一相为特异性抗原，用a、b、c……表示；第二相为共同抗原，用1、2、3……表示。
③表面抗原
已证实沙门菌属有Vi、M和5抗原三种。Vi抗原加热60 ℃30 min或经石炭酸处理被破坏，其存在时可阻止O抗原与相应抗体发生凝集。
（5）变异性
①S-R变异
菌落光滑型经人工培养传代后逐渐变成粗糙型。此时菌体表面的特异多糖抗原丧失，在生理盐水中可出现自凝。
②H-O变异
指有鞭毛的沙门菌失去鞭毛的变异。
③相位变异
具有双相H抗原（第Ⅰ相为特异相，第Ⅱ相为非特异相）的沙门菌变成只有其中某一相H抗原的单相菌，称相位变异。
④V-W变异
指失去全部Vi抗原的变异。
3.感染类别
由沙门菌引起的疾病主要分为两大类：一类是伤寒和副伤寒；另一类是急性胃肠炎。其中鼠伤寒沙门菌、猪霍乱沙门菌、肠炎沙门菌等是污染动物性产品，进而引起人类沙门菌食物中毒的主要致病菌。沙门菌污染主要来源于患病的人和动物及其带菌者，主要由其粪便、尿、乳汁以及流产胎儿、胎衣和羊水排出的病菌污染水源、土壤和饲料等，其中饲料和水源的污染是导致沙门氏菌传染的主要原因。各种饲料中均可发现沙门菌，尤其是动物性饲料（如鱼粉）常见。
禽畜感染沙门菌可引起相应的传染病，如猪霍乱、鸡白痢等。一般情况下畜禽肠道带菌率比较高，当动物因患病、衰弱、营养不良、疲劳以致抵抗力降低时，肠道中的沙门菌即可经肠系膜淋巴结和组织进入血液引起全身感染，甚至死亡。例如，猪霍乱沙门菌可引起仔猪副伤寒，急性病例出现败血症变化，死亡率相当高。慢性病例产生坏死性肠炎，影响猪的生长发育。鸡白痢沙门氏菌，主要侵害雏鸡，引起败血症，可造成大批死亡。在成年母鸡则主要引起孵巢炎，可在卵黄内带菌而传给幼雏。
4.致病性
致病因素有侵袭力、内毒素和肠毒素3种，临床上可引起胃肠炎、肠热症、菌血症或败血症等。其中肠热症属法定传染病。
（1）肠热症
即伤寒与副伤寒病，是由伤寒与副伤寒沙门菌所引起的慢性发热症状，为法定传染病之一。
（2）食物中毒
引起食物中毒的沙门菌以鼠伤寒沙门菌、肠炎沙门菌、汤卜逊沙门菌、猪霍乱沙门菌、乙型及丙型副伤寒沙门菌为常见。
（3）慢性肠炎
沙门菌可引起老人和儿童的慢性肠炎。
（4）败血症
多由猪霍乱沙门菌引起。
（5）沙门菌导致局部感染
如颈部、腰部感染等。
5.微生物学检查
（1）标本采集
根据不同疾病采取不同的标本进行分离与培养。肠热症的第一、二周采血液，第二、三周采粪便与尿液。整个病程中骨髓分离细菌阳性率较高。食物中毒采集食物与粪便。
（2）检查方法及鉴定
①分离培养
Ⅰ.粪便
一般将粪便或肛拭子直接接种于SS和麦康凯平板上，用两种培养基的目的是提高标本的阳性检出率。
Ⅱ.血液和骨髓
抽取患者血液5 mL或骨髓0.5 mL，立即接种于含0.5%胆盐肉汤或葡萄糖肉汤5 mL试管中进行增菌，48 h后将培养物移种到血平板和肠道鉴别培养基上，若有细菌生长取菌涂片革兰染色并报告结果。对增菌培养物连续培养7 d，仍无细菌生长时，则报告阴性。
Ⅲ.尿液
取尿液2～3 mL经磺酸盐肉汤增菌后，再接种于肠道菌选择培养基或血平板上进行分离培养，亦可将尿液离心沉淀物分离培养。
Ⅳ.局部感染的脓液。
②鉴定
沙门菌属的鉴定与志贺菌属相同，须根据生化反应和血清学鉴定两方面进行。
Ⅰ.初步鉴定
如为革兰阴性杆菌时做氧化酶试验，阴性时，挑取可疑菌落分别移种于KIA和MIU上，并做生化反应。以沙门菌多价诊断血清做玻片凝集试验。
凡符合KIA：K/A、产气+/-、H2S+/-、MIU：动力+、吲哚-、脲酶-，氧化酶-，触酶+，硝酸盐还原+，以沙门菌多价血清做玻片凝集试验阳性，鉴定为沙门菌属。
Ⅱ.最后鉴定
沙门菌血清学鉴定主要借助于沙门菌O抗原多价血清与O、H、Vi抗原的单价因子血清。甲型副伤寒沙门菌、鼠伤寒沙门菌和伤寒沙门菌分别属于A、B、D血清群。
Ⅲ.血清学诊断
肥达试验：用已知的伤寒沙门菌O、H抗原，甲、乙、丙副伤寒沙门菌H抗原稀释后与被检血清做定量凝集试验，以检测患者血清中抗体的含量，来判断机体是否受沙门菌感染而导致肠热症并判别沙门菌的种类。
细菌性腹泻致病菌实验室分析路径如图10-3所示。
（二）志贺菌检验
1.概述
志贺菌（Shigella spp）为革兰染色阴性杆菌，无鞭毛，有菌毛，在肠道鉴别培养基上形成无色、半透明的菌落，均能分解葡萄糖只产酸不产气，除宋内志贺菌迟缓发酵乳糖外，均不分解乳糖，营养要求不高，在普通琼脂平板上经24 h生长，形成直径达2 mm、半透明的光滑性菌落；志贺菌属中的宋内菌常出现扁平的粗糙型菌落。志贺菌是引起肠道感染的常见致病菌，罕见肠外感染。
2.分类
A群：即痢疾志贺菌，有10个血清型，其中8个型尚可分为3个亚型，是唯一不能发酵甘露醇的志贺菌。
B群：即福氏志贺菌，有13个血清型（包括变形和亚型），各型间有交叉反应。
C群：即鲍氏志贺菌，有18个血清型。
D群：即宋内志贺菌，抗原单一，只有一个血清型，是唯一具有鸟氨酸脱羧酶的志贺菌。
3.致病性与免疫性
（1）致病物质
主要是侵袭力和内毒素，有的菌株尚产生外毒素。
①侵袭力
借菌毛黏附，穿入回肠末端和结肠黏膜上皮细胞，在上皮细胞内繁殖，形成感染灶，引起炎症反应。细菌一般不进入血流。志贺菌穿透上皮细胞的能力，由基因所控制。志贺菌只有侵入肠黏膜后才能致病。
②内毒素
Ⅰ.作用于肠黏膜，使通透性增高，促进对内毒素的吸收，引起发热、神志障碍等。
Ⅱ.破坏肠黏膜，形成炎症、溃疡，呈现典型的脓血黏液便。内毒素还能作用于肠壁植物神经系统，使肠功能发生紊乱，肠蠕动失调和痉挛，尤其是直肠括约肌痉挛最明显，因而出现腹痛、里急后重等症状。
图10-3 细菌性腹泻致病菌实验室分析路径图
③外毒素
A群志贺菌Ⅰ型和Ⅱ型还能产生外毒素，称志贺毒素，使蛋白质合成中断（上皮细胞损伤）。
（2）所致疾病
传染源是病人和带菌者
传播途径主要为粪-口，人类对志贺氏菌较易感。
痢疾志贺菌引起病情较重；宋内志贺菌多引起轻型感染；福氏志贺菌感染易转变为慢性，病程迁延；福氏志贺菌和宋内志贺菌是我国常见的流行型别。
临床感染类型
①急性菌痢
局部症状有脓血便、腹痛、里急后重。
急性中毒性菌痢，以小儿多见，无明显的消化道症状，主要表现全身严重的中毒症状，各型志贺菌都有可能引起，临床主要有高热、神志障碍、休克，病死率较高。
②慢性菌痢
病程＞2个月，迁延不愈，局部症状为主。
（3）病后建立的型
特异免疫（SIgA）短暂，不持久，无交叉。
4.微生物学检查
（1）黏液脓血便，肛拭子标本
（2）分离培养与鉴定
标本接种肠道鉴别或选择培养基，37 ℃24 h后取无色较透明菌落进行生化反应和血清学试验，以确定菌群和菌型。
（3）毒力试验
测定志贺菌的侵袭力可用Senery试验（致豚鼠角膜结膜炎）。
（4）快速诊断法
①免疫染色法：镜下观察有无凝集现象。
②免疫荧光菌球法：简便，快速，特异性高。
③协同凝集试验：查粪便中有无志贺菌可溶性抗原。
④乳胶凝集试验：既可查抗原又可查抗体。
⑤分子生物学方法：PCR、核酸杂交等查细菌DNA。
5.结果分析
（1）粪便标本直接检查
主要有抗原检测和核酸检测。
（2）志贺菌的分离培养及鉴定
本菌在肠道选择性培养基上菌落小到中等，由于不发酵乳糖使菌落无色半透明，宋内志贺菌常为粗糙型菌落。基本生化反应特征为：葡萄糖发酵阳性、乳糖发酵阴性、枸橼酸盐阴性、脲酶阴性、动力阴性、VP试验阴性。对生化反应符合者必须进行血清学分型鉴定。
志贺菌的分离培养及鉴定流程如图10-4所示。
图10-4 志贺菌的分离培养及鉴定流程
（三）弯曲菌检验
1.概述
弯曲菌属（Campylobacter spp）是一类弯曲或螺旋形的无芽孢、有单端鞭毛的革兰阴性、微需氧菌，不分解糖类，氧化酶阳性，菌体弯曲呈逗点状、S形或螺旋状，有动力，包括5个种和5个亚种。对人类致病的主要是空肠弯曲菌和胎儿弯曲菌胎儿亚种。前者是人类腹泻最常见的病原菌之一，后者在免疫功能低下时可引起败血症、脑膜炎等。常定居在家禽的肠道，可导致人类致病的有空肠弯曲菌、大肠弯曲菌、胎儿弯曲菌等，其中空肠弯曲菌是引起人类肠道感染的常见病原菌之一。弯曲菌属是1973年由Veron等建议确定的一个与人类疾病有关的新菌属，归于螺菌科。
2.生物学形状
（1）形态染色
革兰阴性、细长、螺旋形或海鸥展翅状、S形的弯曲杆菌。一端或两端具有单鞭毛，运动活泼，有时呈螺旋状运动。一端单鞭毛多见于胎儿亚种，两端单鞭毛多见于空肠弯曲菌，无芽孢，无荚膜。
（2）培养特性
微需氧菌，初次分离时需在含5%O2、85%N2、10%CO2气体环境中生长，传代培养时能在10%CO2环境中生长。
本属菌最适生长温度随菌种而异（生长温度差异可作为菌种鉴别要点）。营养要求高，在普通培养基上不生长，需加入血液、血清才能生长。常用的选择培养基有Skirrow琼脂培养基和Campy-BAP培养基。这些培养基以血琼脂为基础，加入多种抗生素，能抑制肠道正常菌群，而有利于本菌的分离。空肠弯曲菌初次分离时，经48 h培养可形成两种菌落：一种为扁平、湿润、灰白色、半透明、边缘不整齐、常沿接种线扩散生长的菌落；另一种为圆形、凸起、半透明、针尖状、有光泽、单个细小菌落。两种菌落均不溶血。在布氏肉汤内呈均匀混浊生长。(https://www.daowen.com)
（3）生化反应
本属细菌生化反应不活泼，不分解糖类、不液化明胶、不分解尿素，V-P和甲基红试验均阴性。氧化酶均为阳性，大多数弯曲菌能还原硝酸盐，触酶试验为阳性，空肠弯曲菌马尿酸水解试验阳性。
（4）抗原结构
有菌体（O）抗原、热不稳定抗原和鞭毛（H）抗原。根据O抗原可将空肠弯曲菌分为42个血清型。
（5）抵抗力
抵抗力较弱，56 ℃5 min即被杀死。干燥环境中仅能存活3 h。
3.微生物学检验
（1）标本采集
立即送检，及时接种。
（2）检验方法及鉴定
①直接涂片
Ⅰ.悬滴标本检查
显微镜下观察有无投镖式或螺旋状运动的细菌。
Ⅱ.革兰染色检查
为革兰阴性逗点状、S形或螺旋状小杆菌。
②分离培养
粪便和肛拭子标本直接接种于改良弯曲菌琼脂平板（如改良的Skirrow血琼脂平板和Campy-BAP平板）；血液或脑脊液标本接种布氏肉汤增菌后，转种弯曲菌分离培养基，置42 ℃、37 ℃，在微需氧环境下培养24～72 h，观察菌落特征。
③鉴定
革兰阴性细小弯曲杆菌，单鞭毛具有投镖样或螺旋样动力，有氧环境不生长，微氧条件下，在弯曲菌选择培养基上形成两种类型菌落。不分解葡萄糖。弯曲菌属的鉴定要点为氧化酶阳性，革兰阴性，菌体弯曲或呈S形。最常用的鉴定试验有生长温度（25 ℃、37 ℃、42 ℃）试验、过氧化氢酶试验、马尿酸盐水解试验、硝酸盐和亚硝酸盐还原试验、硫化氢试验等。
4.结果分析
（1）粪便标本直接检查
主要有粪便与肛拭子的直接显微镜检查，查找弯曲菌，呈S形或螺旋形并呈快速投镖式或螺旋式运动的细菌，以此做初步诊断。
（2）弯曲菌的分离培养与鉴定
粪便或肛拭子可直接接种于改良的Campy-BAP选择平板，可出现灰白、湿润、边缘不齐蔓延生长的菌落和半透明、圆形、凸起、有光泽的小菌落等两种菌落形态。可用常规生化试验将弯曲菌鉴定到种。乳胶凝集试验将弯曲菌鉴定到属，也可用MALDTOF-MS技术对弯曲菌进行初步鉴定。
弯曲菌的分离培养鉴定流程如图10-5所示。
图10-5 弯曲菌的分离培养鉴定流程
（四）霍乱弧菌检验
1. 概述
霍乱弧菌属是兼性厌氧的革兰阴性弯曲杆菌，菌体短小呈逗点状，有单鞭毛、菌毛，部分有荚膜，共分为139个血清群，其中O1群和O139群可引起霍乱。
霍乱弧菌是人类霍乱的病原体，霍乱是一种古老且流行广泛的烈性传染病之一，曾在世界上引起多次大流行，主要表现为剧烈的呕吐、腹泻、失水，死亡率甚高。霍乱属于国际检疫传染病。
弧菌属共有36种，有12种与人类感染相关，在我国引起胃肠道感染最常见的弧菌为霍乱弧菌和副溶血弧菌，约占弧菌引起的胃肠道感染的70%。除了传统生化鉴定技术外，PCR技术和MAL D-TOF-MS技术也可以对霍乱弧菌和副溶血弧菌进行初步鉴定。
霍乱是由霍乱弧菌所引起的。O1和O139这两种霍乱弧菌的血清型能够引起疾病暴发。大多数的疾病暴发由O1型霍乱弧菌引起，而1992年首次在孟加拉国确定的O139型仅限于东南亚一带。非O1非O139霍乱弧菌可引起轻度腹泻，但不会造成疾病流行。最近，在亚洲和非洲的一些地区发现了新的变异菌株。观察认为，这些菌株可引起更为严重的霍乱疾病，死亡率更高。
霍乱弧菌存在于水中，最常见的感染原因是食用被患者粪便污染过的水。霍乱弧菌能产生霍乱毒素，造成分泌性腹泻，即使不再进食也会不断腹泻，洗米水状的粪便是霍乱的特征。
2.病因
霍乱是由霍乱弧菌所引起的。霍乱弧菌为革兰染色阴性，对干燥、日光、热、酸及一般消毒剂均敏感。霍乱弧菌产生致病性的是内毒素及外毒素。正常胃酸可杀死弧菌，当胃酸暂时低下时或入侵病毒菌数量增多时，未被胃酸杀死的弧菌进入小肠，在碱性肠液内迅速繁殖，并产生大量强烈的外毒素。这种外毒素具有ADP-核糖转移酶活性，进入细胞催化胞内的NAD+的ADP核糖基共价结合亚基上后，会使这种亚基不能将自身结合的GTP水解为GDP，从而使这种亚基处于持续活化状态，不断激活腺苷酸环化酶，致使小肠上皮细胞中的cAMP水平增高，导致细胞大量钠离子和水持续外流。这种外毒素对小肠黏膜的作用引起肠液的大量分泌，其分泌量很大，超过肠管再吸收的能力，在临床上出现剧烈泻吐，严重脱水，致使血浆容量明显减少，体内盐分缺乏，血液浓缩，出现周围循环衰竭。由于剧烈泻吐，电解质丢失、缺钾缺钠、肌肉痉挛、酸中毒等，甚至发生休克及急性肾衰竭。
3.临床表现
（1）泻吐期
泻吐期多以突然腹泻开始，继而呕吐。一般无明显腹痛，无里急后重感。每日大便数次甚至难以计数，量多，每天2000～4000 mL，严重者8000 mL以上。初为黄水样，不久转为米泔水样便，少数患者有血性水样便或柏油样便，腹泻后出现喷射性和边疆性呕吐，初为胃内容物，继而水样、米泔水样。呕吐多不伴有恶心，喷射样，其内容物与大便性状相似。少部分的患者腹泻时不伴有呕吐。由于严重泻吐引起体液与电解质的大量丢失，出现循环衰竭，表现为血压下降、脉搏微弱、血红蛋白及血浆相对密度显著增高，尿量减少甚至无尿。机体内有机酸及氮素产物排泄受障碍，患者往往出现酸中毒及尿毒症的初期症状。血液中钠、钾等电解质大量丢失，患者出现全身性电解质紊乱。缺钠可引起肌肉痉挛，以腓肠肌和腹直肌为最常见。缺钾可引起低钾综合征，如全身肌肉张力减退、肌腱反射消失、鼓肠、心动过速、心律不齐等。由于碳酸氢根离子的大量丢失，可出现代谢性酸中毒，严重者神志不清，血压下降。
（2）脱水虚脱期
脱水虚脱期患者的外观表现非常明显，严重者眼窝深陷，声音嘶哑，皮肤干燥皱缩、弹性消失，腹下陷呈舟状，唇舌干燥、口渴欲饮，四肢冰凉、体温常降至正常以下，肌肉痉挛或抽搐。
（3）恢复期
少数患者（以儿童多见）此时可出现发热性反应，体温升高至38～39 ℃，一般持续1～3 d后自行消退，故此期又称为反应期。病程平均3～7 d。
4.检查方法
（1）血液检查
红细胞计数和血红蛋白增高，白细胞计数增高，中性粒细胞及大单核细胞计数增多。血清钾、钠、氯化物和碳酸盐降低，血pH下降，尿素氮增加。治疗前由于细胞内钾离子外移，血清钾可在正常范围内，当酸中毒纠正后，钾离子移入细胞内而出现低钾血症。
（2）尿检查
少数患者尿中可有蛋白、红细胞、白细胞及管型。
（3）病原菌检查
①常规镜检
可见黏液和少许红细胞、白细胞。
②涂片染色
取粪便或早期培养物涂片做革兰染色镜检，可见革兰阴性稍弯曲的弧菌。
③悬滴检查
取新鲜粪便做悬滴或暗视野显微镜检，可见运动活泼呈穿梭状的弧菌。
④制动试验
取急性期患者的水样粪便或碱性蛋白胨水增菌培养6 h左右的表层生长物，先作暗视野显微镜检，观察动力。如有穿梭样运动物时，则加入O1群多价血清一滴，若是O1群霍乱弧菌，由于抗原抗体作用，则凝集成块，弧菌运动即停止。如加O1群血清后，不能制止运动，应再用O139血清重做试验。
⑤增菌培养
所有怀疑霍乱患者的粪便，除做显微镜检外，均应做增菌培养。粪便留取应在使用抗菌药物之前，且应尽快送到实验室作培养。增菌培养基一般用pH8.4的碱性蛋白胨水，36～37 ℃培养6～8 h后表面能形成菌膜。此时应进一步做分离培养，并进行动力观察和制动试验。
⑥分离培养
常用庆大霉素琼脂平皿或碱性琼脂平板。前者为强选择性培养基，36～37 ℃培养8～10 h霍乱弧菌即可长成小菌落。后者则需培养10～20 h。选择可疑或典型菌落，应用霍乱弧菌“O”抗原的抗血清做玻片凝集试验，若阳性即可出报告。近年来国外亦有应用霍乱毒素基因的DNA探针，做菌落杂交，可迅速鉴定出产毒O1群霍乱弧菌。
⑦PCR检测
新近国外应用PCR技术来快速诊断霍乱。其中通过识别PCR产物中的霍乱弧菌毒素基因亚单位CtxA和毒素协同菌毛基因（TcpA）来区别霍乱菌株和非霍乱弧菌，然后根据TcpA基因的不同DNA序列来区别古典生物型和埃尔托生物型霍乱弧菌。4 h内可获结果。
⑧鉴别试验
常用于古典生物型、埃尔托生物型和O139型霍乱弧菌的鉴别。
（4）血清学检查
可作血清凝集试验。在发病第1～3 d及第10～15 d各取1份血清，若第2份血清的抗体效价比第1份增高4倍或4倍以上，有诊断参考价值。
5.诊断
（1）确诊标准
①凡有腹泻、呕吐等症状，大便培养霍乱弧菌阳性者；
②霍乱流行期在疫区有典型霍乱症状而大便培养阴性无其他原因可查者，如有条件可做双份血清凝集素试验，滴度4倍或4倍以上可诊断；
③疫源检测中发现粪便培养阳性前5天内有腹泻症状者，可诊断为轻型霍乱。（2）疑似标准
①凡有典型泻吐症状的非疫区散发病例，在病原学检查确诊前；
②霍乱流行期，曾接触霍乱患者，有腹泻症状而无其他原因可查者。
（3）其他
血清学检查适用于病后追溯诊断，无助于早期确诊。
诊断须鉴别下述腹泻病：
①痢疾；
②由沙门菌、葡萄球菌、变形杆菌等引起的细菌性食物中毒；
③副溶血弧菌引起的腹泻；
④产肠毒素大肠菌性腹泻；
⑤病毒性（特别是轮状病毒性）胃肠炎；
⑥寄生虫性腹泻；
⑦某些毒物（如有机磷农药、三氧化二砷等）引起的腹泻。
轻型不典型的霍乱病例诊断鉴别较难，一般仅有轻度腹泻，不伴有呕吐，血压、脉搏正常，神志清楚，病程短，于两三天内自行痊愈。暴发型霍乱或干性霍乱比较少见，起病后未见吐泻或脱水，而却迅速转入休克状态和严重的中毒性循环衰竭，病死率极高。
霍乱弧菌的分离培养鉴定流程如图10-6所示。
图10-6 霍乱弧菌的分离培养鉴定流程
（五）副溶血弧菌检验
1.概述
副溶血性弧菌（vibrio parahemolyticus，VP）是一种常见的病原菌，是一种嗜盐性的革兰阴性菌，可以发酵葡萄糖，不产气，不能利用蔗糖和乳糖，不产生硫化氢，氧化酶试验呈现阳性，赖氨酸脱缩酶和鸟氨酸脱缩酶试验呈现阳性，二精氨酸脱缩酶试验呈现阴性。副溶血性弧菌食物中毒，是进食含有该菌的食物所致，这些食物主要是海产品，如墨鱼、海鱼、海虾、海蟹、海蜇，以及含盐分较高的腌制食品，如咸菜、腌肉等。本菌存活能力强，在抹布和砧板上能生存1个月以上，在海水中可存活47 d。临床上以急性起病、腹痛、呕吐、腹泻及水样便为主要症状。本病多在夏秋季发生于沿海地区，常造成集体发病。由于海鲜空运，内地城市病例也渐增多。此菌对酸敏感，在普通食醋中5 min即可被杀死；对热的抵抗力也较弱。副溶血性弧菌食物中毒多发生在6—10月海产品大量上市时。引起中毒的食品主要是海产品，其次为咸菜、熟肉类、禽肉、禽蛋类，约有半数中毒者为食用了腌制品后。中毒原因主要是烹调时未烧熟煮透或熟制品被污染。
2.流行病学
（1）传染源
传染源为病人，集体发病时往往仅少数病情严重者住院，而多数未住院者可能成为传染源，但由于病人仅在疾病初期排菌较多，其后排菌迅速减少，故不至因病人散布病菌而造成广泛流行。
（2）传播途径
本病经食物传播，主要的食物是海产品或盐腌渍品，常见者为蟹类、乌贼、海蜇、鱼、黄泥螺等，其次为蛋品、肉类或蔬菜。进食肉类或蔬菜而致病者，多因食物容器或砧板污染所引起。
（3）地区分布特点
日本及我国沿海地区为副溶血性弧菌食物中毒发病率的高发区。据调查，我国沿海水域、海产品中副溶血性弧菌检出率较高，尤其是气温较高的夏秋季节。但近年来随着海产食品的市场流通，内地也有副溶血性弧菌食物中毒的散在发生。
（4）季节性特点及易感性
7—9月常是副溶血性弧菌食物中毒的高发季节。男女老幼均可患病，但以青壮年为多，病后免疫力不强，可重复感染。
（5）食物的种类
主要是海产品，其中以墨鱼、带鱼、虾、蟹最为多见，如墨鱼的带菌率达93%；其次为盐渍食品。食品中副溶血性弧菌的来源：人群带菌者对各种食品的直接污染。沿海地区饮食从业人员、健康人群及渔民副溶血性弧菌带菌率为11.7%左右，有肠道病史者带菌率可达31.6%～88.8%。间接污染，沿海地区炊具的副溶血性弧菌带菌率为61.9%，被副溶血性弧菌污染的食物，在较高温度下存放，食用前加热不彻底或者生吃，或熟制品受到带菌者、带菌的生食品、带菌容器及工具等的污染。
3.临床表现
潜伏期自1 h至4 d不等，多数为10 h左右。起病急骤，常有腹痛、腹泻、呕吐、失水、畏寒及发热。腹痛多呈阵发性绞痛，常位于上腹部、脐周或回盲部。腹泻每日3～20余次不等，大便性状多样，多数为黄水样或黄糊便。约2%～16%呈典型的血水或洗肉水样便，部分病人的粪便可为脓血样或黏液血样，但很少有里急后重。
由副溶血性弧菌引起的食物中毒一般表现为急性发病，潜伏期2～24 h，一般为10 h发病。主要的症状为腹痛，优势腹痛在脐部附近。腹痛是本病的特点，多为阵发性绞痛，并有腹泻、恶心、呕吐、畏寒发热，大便似水样。便中混有黏液或脓血，部分病人有里急后重，重症患者因脱水使皮肤干燥及血压下降造成休克。少数病人可出现意识不清、痉挛、面色苍白或发绀等现象，若抢救不及时，呈虚脱状态，可导致死亡。
由于吐泻，患者常有失水现象，重度失水者可伴声哑和肌痉挛，个别病人血压下降、面色苍白或发绀以至意识不清。发热一般不如菌痢严重，但失水则较菌痢多见。国内报道的副溶血性弧菌食物中毒，临床表现不一，可呈典型、胃肠炎型、菌痢型、中毒性休克型或少见的慢性肠炎型。本病病程自1 d到6 d不等，可自限，一般恢复较快。
4.实验室检查
（1）溶血性试验
用高盐血琼脂培养基，在限定的条件下培养副溶血性弧菌时出现的溶血反应，称此溶血性为“神奈川现象”。
此试验要求是用人或兔的新鲜红细胞制备高盐血平板，经37 ℃、24 h培养，如在单个菌落周围呈现透明溶血环或在菌落下面有明显溶血者，为“神奈川现象”阳性，若不出现透明溶血环或无明显溶血者，为“神奈川现象”阴性。有致病性的副溶血性弧菌，多数为神奈川现象阳性，但亦有少数为阴性。
（2）血清学试验
副溶血性弧菌有三种抗原，即O抗原（菌体抗原）、K抗原（荚膜抗原）及H抗原（鞭毛抗原），其中血清学分类上有意义的是前两者：O抗原有13种血清群，K抗原有65种血清型。
进行副溶血性弧菌血清学鉴定时，可用O抗原分群，将18～24 h的培养物，用3%食盐水做成较浓的菌悬液，121 ℃高压1 h或100 ℃煮沸后，用此菌悬液进行O抗血清玻片凝集试验，同时用无菌生理盐水做对照，如O凝集反应阳性时，可用不经加热的菌悬液进行K抗血清玻片凝集反应分型判定。天津生物芯片公司的诊断血清产品覆盖了该菌所有的O血清群及K血清型。
（3）核酸扩增试验
所有副溶血性弧菌分离株都含有不耐热溶血毒素（TLH），这种溶血毒素是副溶血性弧菌所特有的，因此它的编码基因tlh基因常被用作检测副溶血性弧菌的靶基因。而tlh并不是一个毒素基因，真正与致病相关的是副溶血性弧菌的耐热直接溶血素（TDH）和溶血性相关溶血素（TRH），因此它们的编码基因tdh、tlh基因常被用作副溶血性弧菌致病性检测的特异基因。基于此，天津生物芯片推出了一系列常规PCR试剂盒及荧光PCR试剂盒。
①常规PCR
鉴定标准是通过电泳来判断是否有扩增的核酸片段以及扩增产物的大小是否正确。
②实时荧光PCR
通过对实时荧光PCR反应的每一个循环产物进行荧光信号的实时监测来判断分析。
（4）嗜盐性试验
目的：副溶血性弧菌具有嗜盐性，此试验为探究它最适宜生长的盐浓度。
①配置胰蛋白胨水50 mL，分装到5支试管，每支试管都是9 mL（配多5 mL只是怕实验过程有损耗）。
②在5支试管按量分别加入0%、3%、6%、8%、10%的NaCl。
③在纯培养的3%NaCl胰蛋白胨大豆琼脂中挑取单个可疑菌落分别介入上述的5支试管中。
副溶血性弧菌检验流程如图10-7所示。
图10-7 副溶血性弧菌检验流程