实训6　鸡胚成纤维细胞原代分离培养

实训6　鸡胚成纤维细胞原代分离培养

【实训目的】

1.掌握鸡胚成纤维细胞的分离与培养方法。

2.掌握细胞计数的方法。

【实训原理】

细胞培养分原代培养和传代培养。原代培养是由体内取出组织，经消化酶（常用胰蛋白酶和胶原酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，将其分散成单细胞，置于合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖。原代培养细胞离体时间短，遗传性状和体内细胞相似，适于做细胞形态、功能和分化等研究。原代培养细胞移动性较强，细胞分裂不旺盛，存在异质性细胞。

所有组织中都有一定量的细胞间质（纤维和基质等），对细胞生长有妨碍作用，用胰蛋白酶消化能去除间质，使组织松散成单个细胞或小细胞团，易于细胞生长。

【试剂与主要用品】

1.仪器用具：照蛋灯与蛋座、碘酊棉球与酒精棉球、大剪子、眼科剪、小镊子、平皿、细菌瓶、吸管、吸球、细胞瓶、9～12日龄鸡胚。

2.试剂：0.25%胰酶、DMEM培养液、生长液（含10%犊牛血清、200 U／mL青霉素、200μg／mL链霉素的DMEM液）。

【操作步骤】

具体操作步骤如下：

①取9～12日龄鸡蛋用新洁尔灭消毒10 min后，大头朝上置于操作台内。依次用碘酊和酒精消毒气室部。去除气室部卵壳和壳膜，穿破绒毛尿囊膜，夹住鸡胚颈部，取出鸡胚放于灭菌平皿中。

②用眼科剪、小镊子去除鸡胚头、四肢及内脏，用无血清的DMEM冲洗2次。(https://www.daowen.com)

③将冲洗后的鸡胚用剪子充分剪碎，使其近于乳糜状。

④将剪碎的组织块倒入细菌瓶中，加入5 mL无血清DMEM，振摇几次，静置几分钟，吸弃洗液。如此重复1次。

⑤加5mL胰酶，在37℃水浴中消化20～30min，其间需不时摇动，使细胞消化完全（组织块变松散，沉降渐变缓慢时即表示消化足够）。

⑥消化好后，取出瓶子，静置几分钟，吸去胰蛋白酶液。

⑦加DMEM生长液5 mL，轻轻摇动几次后，静置几分钟吸去。如此重复1次。

⑧加入生长液5 mL，以粗口吸管吹吸数次，使细胞脱落分散，静置几分钟，使未消化好的组织块下沉。

⑨轻轻吸取上层细胞悬液于细胞培养瓶中，每瓶0.2～0.5 mL，补加DMEM生长液至10 mL，使细胞量为（4～6）×105个／mL，盖上盖子，置于37℃CO2恒温箱中培养。细胞贴壁后延展成长梭形，培养7～10天后即可长成致密单层细胞。

⑩细胞计数方法。取细胞悬液（0.5+2）mL 0.1%结晶紫—枸橼酸（0.1 mol／L）溶液，室温或37℃温箱中5～10 min，充分振荡后进行计数。按白细胞计数法计算4角4个大方格内的细胞总数（N）。

每毫升悬液中的细胞数（n）＝N／4×10 000×K（稀释倍数）

【结果与讨论】

1.记录每天观察细胞生长情况和培养液颜色变化。

2.鸡胚原代细胞培养时应注意哪些问题？