对亨廷顿病的研究新进展
近年来，越来越多的国内外科学家们都聚焦亨廷顿病的发病机制研究，继世界首只转基因亨廷顿病猴的病理模型建立后，由我国科学家主导，采用体细胞核移植和基因编辑（CRISPR/Cas9）技术，在猪模型上取得重大突破。将人突变的亨廷顿基因，即人外显子1中包含150 CAG重复序列精确地插入猪的HTT内源性基因中，利用成纤维细胞筛选出阳性克隆细胞，成功培育出世界首例亨廷顿病基因敲入猪，建立了与中枢神经退行性疾病患者突变基因相类似的大动物模型，精准地模拟了人类亨廷顿病。
亨廷顿病基因敲入猪模型不仅模拟了亨廷顿病患者脑中特异性神经元选择性死亡的典型病理特征，而且还表现出类似人亨廷顿病舞蹈样动作的行为特点。更重要的是，这些病理特征及异常行为都可以稳定地遗传给后代，为亨廷顿病的后续研究奠定了坚实的基础。
（一）基因干预
随着我国的人口老龄化，老年人口基数增加，医疗进步和生活水平提高，老年人预期寿命延长。当下，亨廷顿病存在两大问题：首先未被确诊。由于经济问题和心理负担，很多有家族遗传史的患者因为不愿意去做基因检测而未被确诊；其次，治疗不足。亨廷顿病的病程长，但是由于未被规范治疗或诊断，患者被病情耽误以至于生活质量差。近年来基因治疗逐步成为亨廷顿病的治疗热点。随着反义核苷酸疗法获得初步进展，针对mRNA及基因组水平的治疗研究也相继开展临床试验。下面介绍几类针对毒性蛋白HTT的基因治疗方法。
1.针对毒性HTT蛋白的基因干预
亨廷顿病为常染色体显性遗传，亨廷顿基因的编码产物为HTT蛋白。由于亨廷顿基因的突变，导致HTT蛋白发生变异并聚集形成包涵体。目前已知突变HTT蛋白具有一定的神经毒性，可引发一系列病理生理改变。理论上抑制突变HTT蛋白的表达或促进其降解，均可使突变HTT蛋白的功能降低，从而达到治疗亨廷顿病的目的。但研究发现，抑制突变HTT蛋白的生成的效率要远高于促进降解。
在突变HTT蛋白的生成过程中，mRNA缺乏自我修复机制，通过干扰或者阻止mRNA的转录或者翻译，来抑制脑组织中突变HTT蛋白的表达。从以下3个方面阐述亨廷顿病的治疗策略：ASO疗法、RNA干扰、等位基因特异性治疗以及调控mRNA剪接的小分子化合物。
ASO疗法
ASO是人工合成的单链DNA或RNA，具有一定的核酸酶抗性以及mRNA亲和性，与mRNA结合后可诱导其被核糖核酸酶H（RNase H）降解。增强疗效的同时减轻相应的非特异毒副反应。目前，已用于亨廷顿病的临床试验的ASO，主要是经过O-MOE修饰后的靶向人源HTT mRNA的第二代反义寡核苷酸。Ⅰ期临床试验显示与患者脑脊液中突变HTT蛋白含量的降低程度与患者部分认知、运动相关临床诊断评估改善相关，呈现浓度相关性提示临床获益，并且未报告严重不良反应。因此ASO疗法能否改善亨廷顿患者的临床症状值得期待，优化ASO疗法的给药方式及充足的样本量设计，均匀各脑区间疗效。通过共价缀合某些多肽或小分子等方式，实现ASO靶向BBB上相应受体，增强其透过能力，解决鞘内注射ASO到达深部脑组织的量极其有限的弊端，扩大ASO在全脑范围内的血流分布。
RNA干扰
RNA干扰目的是实现目标基因沉默，首先依靠载体向脑组织引入特定序列RNA（此类双链RNA扩散范围有限），通过核糖核酸酶沉默复合物的形成，并与特定序列mRNA结合，诱导其降解。通过病毒转染，使得外源序列得以长期稳定表达，使目的细胞产生前体成分，实现基因沉默。目前多采用脑内定位注射病毒载体的方式，如定位于纹状体，能够显著抑制纹状体突变HTT蛋白，减少蛋白的聚集及神经元死亡，研究显示单次给药后疗效维持时间达1年甚至以上。但此方法也有弊端，即注射病毒载体及外源序列需要辅助外科手术，易致诸多不良反应。风险系数安全性较高，转染效率、转染区域以及治疗存在局限性等问题使得RNA干扰治疗研究进展缓慢。
等位基因特异性治疗
研究发现，亨廷顿病患者多同时携带具有正常功能的HTT基因以及突变HTT基因，也就是杂合突变。正常HTT基因的功能尚不明确，但目前大部分基因治疗策略主要针对正常HTT基因和突变HTT基因的共有序列，因此存在潜在风险，在抑制突变HTT基因表达的同时，也会降低了正常HTT基因而致使发育障碍。等位基因特异性的基因治疗则是针对突变HTT基因的精准定位，目标人群为具有能够被靶向的SNP位点的杂合度较高的亨廷顿病患者。
随着对亨廷顿病致病基因序列的研究深入，逐渐获得更多高频的候选位点，筛选更多能够被靶向的结合位点，通过优化药物结构结合变异类型、周边序列以及药物对于靶向序列微小差异的识别敏感度，实现低风险等位基因特异性治疗，这必将成为未来亨廷顿病治疗的发展趋势。
调控mRNA剪接的小分子化合物
调控mRNA剪接的小分子化合物是一类实现靶向RNA治疗亨廷顿病的治疗策略。通过不同构象的药物靶向不同mRNA剪接机制，诱导pre-mRNA的错误剪接和降解，实现基因沉默。不同于ASO疗法以及RNA干扰等治疗策略，调控mRNA剪接的小分子化合物直接干扰RNA的剪接过程，而非基于碱基互补配对的靶向机制，应用中应注意脱靶效应。调控mRNA剪接的小分子化合物给药方式为口服，可通过血脑屏障抵达中枢。
2.DNA水平的基因编辑纠正(https://www.daowen.com)
DNA水平的基因编辑纠正治疗是指直接删除或纠正致病突变基因组DNA，尤其适合单基因遗传病的治疗。研究发现，HTT基因参与机体的生长发育新陈代谢过程，如过早敲除HTT基因则致死率大大增加。DNA水平的基因编辑区域较广，种类繁多，正常HTT基因表达的蛋白功能尚不明确，因此不建议直接破坏正常HTT基因部分，以及过早使用DNA水平的基因编辑纠正治疗。此治疗方法不可逆，则对DNA水平的基因编辑要求较高。目前科学家们利用静脉注射的脂质体等非病毒载体将外源mRNA导入猕猴神经元实现基因编辑，指导合成功能蛋白。在相关mRNA指导下，目的细胞短期合成基因编辑所需元件。成功编辑基因后，相关外源基因的表达与疗效无相关性。
（二）面临的挑战
亨廷顿病的基因治疗逐步成为医学家们研究的热点，基因治疗的主要目标是降低亨廷顿患者脑内突变HTT蛋白的表达，最大限度延缓神经元死亡的进程，进而逆转及中止疾病进展。那么，如何使外源基因持续稳定高效的表达是基因治疗亟待解决的挑战。
1.治疗时机的选择
亨廷顿病的临床治疗原则仍然是尽早治疗，延迟甚至防止发病。确诊亨廷顿病患者主要依靠典型的舞蹈样动作或锥体外系运动障碍，并参考阳性家族史或基因诊断结果。而一些被诊断为亨廷顿病携带者或症状前亨廷顿病患者则是尚未出现运动症状的个体，但基因诊断呈阳性。症状期亨廷顿病患者则会出现行为异常及运动症状并伴有认知情感功能障碍。根据整体功能表现程度的评估，将症状期亨廷顿病分为早期、中期及晚期。目前基因治疗临床试验主要招募早期亨廷顿病患者，这部分患者脑内中枢病理生理改变较轻，临床效果较好获益较大，而且这部分患者可针对已有明显改变的生物标志物进行疗效评估。但是，亨廷顿病由功能获得型基因突变导致致病蛋白的表达，从患者出生到出现轻微症状，都持续影响神经元的活性，并且可能已经造成相当数量的神经元丢失。因此，尽早预测或发现潜在发病患者，对于亨廷顿病及时开展治疗具有重要意义。
2.治疗疗效的评估
任何一种疾病都需要筛选出能够更加客观、精确、有效、灵敏的反应药物治疗疗效的指标，应用于患者了解自身病情，临床试验效果评估、临床决策或药物开发，因为临床症状往往存在一定的滞后性，亨廷顿病也不例外。最早应用于评估病情变化的生物标志物是脑脊液突变HTT蛋白、脑脊液和血浆NfL联合检测等临床队列样本。尽管应用经验有限，但未来进一步普及和推广值得期待。
中枢神经退行性疾病是由于不同大脑区域的神经元及脑阈细胞的死亡引发的神经系统功能紊乱症状。帕金森病与亨廷顿病相似，均会导致中枢支配运动神经部分受损，阿尔茨海默病主要破坏患者大脑的记忆思维功能。有研究结果表明，中枢神经系统退行性疾病的发病机制存在相似之处，诸如都是患者脑内出现异常蛋白质的表达异常折叠以及在脑细胞中的沉积，这些沉积块能够在细胞间传递，蛋白质进入细胞后，将破坏膜泡完整性进入膜泡之中，并释放入胞浆，引起细胞功能紊乱，诱导细胞死亡从而造成大脑损伤。不同类型的神经退行性疾病涉及的蛋白种类有所不同，帕金森病以及亨廷顿病中为alpha-synuclein，阿尔茨海默病中为Tau。相似的方式可以解释中枢神经系统退行性病变（亨廷顿病、阿尔茨海默病或帕金森病等）破坏大脑功能的可能内在机制。所以，亨廷顿病研究成果也必将会给其他中枢神经系统退行性疾病产生借鉴意义。
亨廷顿病是一种常染色体显性遗传的中枢神经系统退行性疾病，由于其具有完全外显的遗传特点，因此亨廷顿病的基因诊断可以为产前诊断和遗传咨询提供可靠的依据。但是，应注意伦理学问题。因为亨廷顿病致病基因的阳性诊断会给尚无临床症状的致病基因携带者带来心理负担和社会压力，甚至影响到以后的就业、婚姻和生活等。因此，强调任何对亨廷顿病家庭成员进行的基因检测都应在受检者充分知道检查结果的意义和局限性，在完全自愿的条件下进行。并且在检查前后给予充分的心理咨询和帮助。
（三）其他研究进展
遗传学方面的进展已经可以帮助我们预测疾病的自然病史和进展情况，但目前有关预测疾病进展的其他方面的生物标志物有限。既往研究显示，有关神经损伤的血液生物标志物可有助于亨廷顿病的临床管理和治疗药物的研发。
英国的学者等进行了一项研究，旨在评估血液神经丝轻链蛋白（NfL）是否可作为预测亨廷顿病患者神经变性的一个潜在的预后标志物。研究者对为期3年的国际性TRACK-HD研究进行了一项回顾性的分析，纳入了亨廷顿蛋白基因CAG扩增突变的携带者和健康对照者。评估血浆NfL浓度与受试者临床和MRI神经影像学表现，即认知功能、运动功能和大脑体积（局灶性和全脑）之间的相关性。采用随机效应模型分析在每一次研究访视点的横断面相关性，以及分析从基线到每次访视点的变化，并对可能的混杂因素进行校正。在37例受试者（23例突变携带者和14例对照者）的独立队列中，另分析血浆NfL与脑脊液NfL浓度的相关性。从97例对照者和201例HTT突变基因携带者中获取了基线和随访期的血浆样本。在基线期，与对照者相比，HTT突变基因携带者的血浆平均NfL浓度显著升高；且两组人群中的这种差异性会随疾病严重程度加重而增加。在任何特定的时间点，血浆NfL浓度均与临床和MRI表现相关。在纵向分析中，基线血浆NfL浓度也与患者后续认知功能、总体功能状况以及脑萎缩情况显著相关。在校正了年龄和CAG重复序列数值后，除了Stroop词语阅读和总体功能状况这两项指标之外，其他的认知功能指标和脑萎缩情况也与基线血浆NfL浓度显著相关。在104例症状前亨廷顿病的患者中，基线血浆NfL浓度与随后3年随访期内发病风险显著相关。在基因突变携带者中，脑脊液和血浆中的NfL浓度显著相关。该研究结论认为，血浆NfL可作为亨廷顿病发病和疾病进展的一个潜在的具有预测性的血液生物标志物。但是NfL水平是否可作为神经保护性治疗有效的生物标志物之一呢？神经元的病理性改变是否也与NfL释放相关，比如神经元死亡或轴索/突触变性？在HD病程的多早期阶段能够观察到NfL水平的升高呢？脑内的NfL是否可直接释放进入血液，又有多少是来自于脑脊液的呢？
以上这些问题都需要通过进一步的研究来探索，可能是动物研究，更重要的是人体研究；此外，开展真实的前瞻性临床研究也十分重要。这项研究是亨廷顿病和整个神经变性病领域的一项重大进展；同时也可能预示着疾病生物学方面的进一步进展；更重要的也可能对实验性治疗方面产生影响。
除基因治疗外，医学家们也在积极探索亨廷顿病的其他可行治疗方案。比如维生素D在预防和治疗中枢神经系统退行性疾病中的潜在应用提供参考，正逐渐引起了人们的高度关注。可为中枢神经系统退行性疾病在老年人群中的发病率较高，除亨廷顿病之外，还有阿尔茨海默病、帕金森病、克-雅氏症等。研究发现，上述疾病的大部分患者都表现出不同程度的维生素D缺乏现象。而给亨廷顿病转基因小鼠补充高剂量的1，25（OH）2D后，受试对象运动性能无影响，但延长了其寿命。维生素D今年来被认为参与多种疾病的发生发展，比如肿瘤、炎症等。提示我们引发老年患者中枢神经系统退行性疾病的参与因素之一有可能是维生素D，而维生素D对亨廷顿病临床治疗具有潜在的意义。
1，25（OH）2D主要是由机体皮肤中的7-脱氢胆固醇经紫外线照射，经两次羟基化转化合成为具有生物学活性的维生素D。老年人群皮肤中储存的7-脱氢胆固醇浓度明显下降，室外活动少，如长期饮食摄取或光照不足时易导致维生素D缺乏。而亨廷顿病患者易摔倒，骨密度降低等很多非神经症状，与其机体调节骨组织代谢的功能显著相关。维生素D缺乏除了能引起老年人骨质疏松症外，还与老年人中枢神经退行性疾病有一定相关性，其机制可能是1，25（OH）2D对神经元发挥了神经保护作用，但仍需进行进一步探索。
随着对HTT基因和蛋白功能等亨廷顿病发病机制基础研究的不断深入，基因工程技术以及各种核酸药物研发取得了飞速发展，期待不久的未来更有效安全方便的治疗方法在临床试验中取得成功，服务于临床，实现病情进展控制甚至根治。