二、孢子分离法
孢子是食用菌的基本繁殖单位。食用菌的孢子具有代谢旺盛、发育强壮、数量多的特点，所以在食用菌生产中常常采用孢子分离法选育具有优良性状的菌株。
孢子分离法是利用成熟子实体的有性孢子能自动从子实层中弹射出来的特性，在无菌条件下和适宜的培养基上获得孢子，使孢子萌发成菌丝，从而获得纯菌丝的方法。孢子分离的菌种菌龄短、生命力旺盛，常作为菌种复壮的一种手段。但孢子产生的菌丝会发生变异，孢子分离法也存在原菌株优良性状难以保存的缺陷。
进行孢子分离时应该选择好种菇。香菇、平菇等无菌膜或菌膜易自动破裂的菇类，应选八成熟、即将释放孢子的菇体，此时采集的孢子基本上是无菌的;双孢蘑菇、草菇等有菌膜的菇类，应挑选菌膜即将破裂的健壮个体，此时种菇已发育成熟，而子实层又未被感染。
种菇采收后要及时切除基部并进行表面消毒。在接种室（箱）内，用75％的酒精、0.1％～0.2％的高锰酸钾溶液进行种菇表面消毒。对于香菇、平菇等子实层裸露的种菇，只能用75％的酒精揩擦菌盖及菌柄表面;对于木耳、银耳类子实体，千万不能接触消毒剂，只能置于烧杯中用无菌水洗涤，再用镊子镊起用无菌水冲洗数次后用无菌纱布吸干表面水分。
（一）孢子的采集
孢子的采集方法较多，有孢子收集器采收法、三角瓶孢子收集法、试管印模收集法等，最常用的是三角瓶孢子收集法。此方法用于双孢蘑菇、香菇、平菇、猴头、草菇、滑菇、木耳、银耳等孢子的收集。以双孢蘑菇为例，其具体操作步骤如下：
1.种菇的选择 双孢蘑菇的种菇，秋菇比春菇好，一般在11月上、中旬，在第一、二潮菇中挑选，最好是第二潮菇。因为这时双孢蘑菇生长最旺盛、菌丝生活力强、子实体健壮、质量好，加上气温适宜，双孢蘑菇能正常成熟。应从菌丝生长健壮有力、无病虫杂菌、出菇均匀、转潮快、子实体生长旺盛的中层菇床上，挑选菇盖肥厚、颜色洁白、菇形圆整、菇柄粗壮的单生菇作为种菇。一般种菇以菌盖4～8 cm、鲜重100 g左右为好。种菇从小就要进行挑选和标记，首先从菇床上选20个符合要求的小菇，从纽扣大小起（约2 cm）就插上标记，注意观察，记录每天的生长情况并加以比较，最后留下2～3个长势最好、个体肥壮的作为种菇。为了使种菇能正常生长，并有充分的养料，可将周围6～10 cm内的小菇拔掉。
用做孢子分离的种菇要达到一定的成熟度。双孢蘑菇种菇采收的标准是：菌膜将破而未破（未开伞），八九分成熟时。为了便于观察，可用小镜子放在菇盖下，当看见菌膜变薄而绷紧、菌膜即将破裂时，轻轻采下。采摘过早，孢子尚未成熟;采摘过迟，菇已开伞，菌褶外露，表面消毒困难，也易杀伤孢子。
种菇采摘后，将菌柄的2/3切除，尽早进行孢子收集。
2.孢子的采集 在250 mL的三角瓶内放置一个“S”形铁丝钩，塞上棉塞后进行灭菌。分离时首先将种菇的菇片进行消毒，再用无菌水冲洗干净，然后用无菌纱布吸干，用手术剪剪取2 cm2大小的小片挂在瓶内的小铁丝钩上，然后放入三角瓶内，铁丝的另一端钩住瓶口（图3.2）。木耳类只能用无菌水冲洗擦干。三角瓶内盛有1 cm厚、事先灭过菌的凝固的PDA培养基。塞紧棉塞。注意操作时不要使菇（耳）片接触培养基或瓶口。然后把悬挂着菇（耳）片的三角瓶从接种箱内取出移入菇（耳）类适宜的温度下培养，当培养基表面有一层白色孢子印时，再移入无菌室（箱）内，及时取出菇（耳）片和钩子，塞好棉塞。
图3.2 三角瓶孢子分离示意图
1.棉塞 2.金属丝 3.小块菇（耳）4.弹射孢子 5.培养基
弹射孢子所需要的温度，因菇的大小而异。种菇一般经1 d左右的培养即可落下孢子。待培养皿内孢子由淡咖啡色转为咖啡色时，要中止孢子弹射，以防成熟过度、生活力较差的孢子混入。
不同的菇类释放孢子的温度不同，在收集孢子时要注意将种菇放在适温下让其自然弹射孢子。
（二）孢子的分离
采集的孢子不经分离也可以在培养基上长出菌丝体。但是采集到的孢子的生理活性及发育程度是不整齐的，其发育的菌丝体中会有长势较弱的菌丝。此外，对于四极性的食用菌来说，孢子之间能配对的概率只有25％，在萌发的菌丝间必然混有许多不孕的菌丝体。因此，采集到的孢子必须经过分离纯化，才能选育出优良的菌株。
孢子的分离分为多孢分离和单孢分离两种。双孢蘑菇和草菇等同宗结合的食用菌的一部分单孢子具有单孢结实的能力，由单孢培养的菌丝，经双核化后形成的双核菌丝一般具有结实的能力，其纯种分离常采用单孢分离法;香菇、平菇、木耳、金针菇等异宗结合的食用菌，其孢子具有性别，单个孢子萌发的菌丝无结实能力，单孢菌丝只有经过交配后才能结实，常采用多孢分离法，如果进行杂交，也可进行单孢分离。
1.多孢分离法 多孢分离就是把采集到的许多孢子接种在同一培养基上，让它们萌发、自由交配，形成异核菌丝，再经过挑选纯化，通过出菇试验后用于栽培。多孢分离法常难以得到理想的菌株。采集到的孢子可以用以下几种方法加以分离：
（1）平板划线法。按无菌操作规程，用接种针蘸取少量孢子悬液，在平板培养基上划线，注意不要划破培养基表面。然后放入适温下培养，待孢子萌发后，挑取萌发早、长势旺的菌落，转接于装有PDA培养基的试管再进行培养即成母种。
（2）直接培养法。将收集到的孢子直接放入恒温箱进行培养，待孢子萌发后挑取长势旺的菌落转接培养成母种。(https://www.daowen.com)
（3）涂布法。在无菌条件下，将采集到的孢子用无菌水稀释成孢子悬液，再在无菌条件下用移液管吸取孢子悬液放入事先经过灭菌的试管斜面或培养皿内，用玻璃刮刀将孢子悬液在试管斜面或培养皿表面涂布均匀，然后进行恒温培养。待孢子萌发时，挑取发育均匀、生长快速的菌落转入新的试管斜面培养成为母种。
选育优良品种，仅从形态上判断是不够的。为了保证母种的质量，还需要做生物学鉴定（如出菇试验），再根据生物学特性和生物学效率等数据，才能确定是否为优良品种。
2.单孢分离法 单孢分离就是将采集到的孢子单个分开进行培养，让它单独萌发成菌丝而获得纯菌种的方法。单孢分离对于杂交育种有十分重要的意义，在人工条件下使两个优良品系的单孢进行杂交，从而培育出新菌株。
从许多孢子中挑选出单个孢子，一般需用单孢分离器。如果没有单孢分离器，也可用稀释法获得单孢。常用的有连续稀释法、平板稀释法。其操作原理是用无菌水把孢子稀释，降低一定体积中孢子的密度，最后使每一滴水中含1～2个孢子。再把含1～2个孢子的水滴滴在琼脂平板上培养，发现单个菌落时立即转移到新的培养基上进行培养，并检查有无锁状联合，以确定是否为单孢菌落。最后编号培养，得到单孢分离菌株。常用在无菌条件下，用灭过菌的注射器吸取5 mL无菌水注入收集孢子的培养皿内，轻轻摇动，使孢子均匀混于水中，制成孢子悬浮液。斜置倾放，使比重大的饱满、健壮的孢子沉于下部。用注射器吸取下层孢子液2～3 mL（也可用注射器吸取下层孢子液，针头朝上放置几分钟，再推动注射器，让比重较小的孢子悬浮液从针口溢出，留下层孢子液2～3 mL）。再吸取2～3 mL无菌水，把孢子液稀释到淡咖啡色（可将孢子液涂载玻片，在显微镜下观察，以每滴孢子液中有4～5个孢子为适）。
将斜面试管的棉塞轻轻拔动，用注射器吸取孢子液，针头从试管壁插入，注入1～2滴孢子液。注射后塞好棉塞，旋转试管，使孢子液均匀分布于斜面培养基上，便于挑选。
将注入孢子液的试管放在23～25℃的恒温箱中培养，经常检查孢子萌发情况和是否有杂菌。
单孢子萌发成的菌丝，在菌落之间尚未相连时，挑取发育均匀、菌丝健壮的单个菌落移入斜面培养基中培养即成纯种。在无菌条件下，用接种铲连同单个菌落周围的培养基一起移入斜面试管中。如果是异宗结合的食用菌则要同时挑选能亲和的一对单菌落进行培养，并经出菇试验后才能用于生产。
另外一种稀释分离法为：准备5支试管，其中一支装10 mL无菌蒸馏水，另外4支各装9 mL无菌蒸馏水。取一接种勺孢子，加入10 mL无菌水的试管中，摇动使孢子分散成孢子悬液。用无菌注射器或吸管取1 mL孢子悬液加入第二支试管，摇动使其分散。依次类推至第五支试管。这种梯度稀释法，每稀释一支试管，悬液中的孢子量就降低10倍。稀释度越高，悬液中的孢子量就越小。从第五支试管取少许稀释液于显微镜下观察，如果孢子单个分开，就达到分离目的，否则就要按此法继续稀释。视孢子量从第四或第五支试管中取0.2 mL孢子悬液加入平板培养基上，用无菌玻璃刮铲，使孢子液均匀涂布于培养基表面，经过适温培养即可得到单个菌落。如果平板上的菌落不是单个存在，说明孢子悬液中孢子量过多，要再进行稀释，重新培养。每次做10个培养皿，以便挑选单个菌落。
也可先制成平板培养基，将一滴孢子液滴在平板培养基中间，再加入一滴吐温80，孢子液被油剂表面张力推散，如上条件培养，也可得到单孢菌落。
（三）孢子的萌发
1.影响孢子萌发的因素
（1）孢子结构影响萌发率。壁薄的孢子，水很容易通过孢壁渗透进入孢子使其萌发。而壁厚的孢子（如草菇），水及营养液只能从孢子孔进入，再由孢子孔萌发出芽管，形成菌丝。因此，这类孢子萌发率很低。
（2）多孢刺激能诱导萌发。多数腐生菌类的孢子都容易萌发，因为孢子呼吸释放出的气体可以刺激孢子萌发。所以，多孢子比单孢子容易萌发。
（3）温度影响孢子萌发。温度显著影响孢子的萌发。不同的食用菌孢子萌发所需要的温度和子实体形成的温度相近。因此，孢子分离时要置于最适温度下培养。
2.诱导孢子萌发的方法
（1）洗净处理。将孢子用无菌水或0.05％磷酸缓冲液（pH值为8.0）浸12 h，然后用滤纸过滤，取其孢子接种和培养，如草菇孢子。
（2）高温处理。将孢子液在40℃下处理48 h，给予“启动”处理后置于25℃下培养。
（3）低温处理。将孢子在－7℃处理10周后移接在25℃下培养。
（4）添加诱导物质。将0.001％～0.01％异戊酸或异戊醇加入培养基中于25℃培养（如双孢蘑菇），可提高萌发率。
（5）在培养基中加天然基质提取液。将菇类的生长基质、腐殖质、土壤或子实体浸取液加入培养基中，可以促进其孢子萌发。这是一种常用的简单有效的方法。如用灵芝子实体浸取液可以促进其孢子萌发。
