7.5 Myc/Max直接调控puc的转录
鉴于Myc作为重要的转录因子调控了基因组中多达15%基因的转录[142]，而Puc则是负调控JNK信号通路的重要蛋白，并且我们的遗传学证据表明Puc位于Myc的下游，因此我们猜测Myc有可能是通过激活puc的转录进而抑制了JNK信号通路介导的细胞迁移。为了验证这个假设，我们首先检测了d Myc对puc转录的影响。我们发现与对照组果蝇唾液腺中很强的内源性puc转录相比（图7-5 C），myc突变体中puc的转录水平明显减低（图7-5 D）。而与此相反的是，当我们在翅成虫盘中沿着前后轴过表达d Myc则可以激活puc表达（图7-5 F），并且这种激活能够被同时过表达d Max进一步增强（图7-5 H），尽管单独过表达d Max不能激活puc转录（图7-5 G）。同样的，过表达c Myc1也能微弱地激活puc转录（图7-5 I），而且c Myc1也能与d Max发生协同作用（图7-5 J），这些结果表明Myc/c Myc1能与d Max一起作用，协同激活puc体内的转录。
此外，我们发现与之前在lgl-Ras眼成虫盘中得到的结果类似，在翅成虫盘后区过表达d Myc能显著地降低内源性的JNK磷酸化水平（图7-5 A，无GFP的为内源对照），而反之下调myc的表达则能够促进体内JNK磷酸化（图7-5 B）。这些证据表明Myc/Max表达能够通过激活puc的转录，因此抑制JNK磷酸化，从而影响了细胞迁移等生理活动过程。
接下来为了验证Myc/Max能否直接调控puc的转录，我们检测了puc的顺式调控区域，找到了3个可能的Myc/Max结合位点（图7-6 A红色竖线标出），也就是E-box（CACGTG）[103]。我们在果蝇S2细胞中共转c Myc1与HA-d Max后进行了染色体免疫共沉淀实验（ChIP），然后在针对这3个结合位点设计相关引物对目的片段进行PCR扩增后发现c Myc1/d Max只能够特异性地在最后一个E-box位点富集（图7-6 B，片段4）。
图7-5 Myc/Max促进体内puc的转录（见彩图15）
（A—B）荧光显微镜3龄幼虫翅成虫盘JNK磷酸化抗体染色图片。在翅成虫盘后部过表达或下调Myc能够相应的抑制（A，en-Gal4 UAS-GFP/+；UAS-d Myc/+）或促进（B，en-Gal4 UAS-GFP/+；UAS-myc-IR/+）体内JNK磷酸化。
（C—J）光学显微镜3龄幼虫唾液腺或翅成虫盘X-Gal染色图片。与对照相比（C，puc E69/+），myc突变体唾液腺中puc表达明显降低（D，dmyc1/Y；puc E69/+）。沿着翅成虫盘前后轴过单独表达d Myc或者c Myc1均能微弱激活puc的表达（F，ptc-Gal4/+；puc E69/UASd Myc，I，ptc-Gal4/+；puc E69/UAS-c Myc1），在此基础上同时过表达d Max能够显著增强puc的表达（H，ptc-Gal4/+；puc E69/UAS-d Myc UAS-d Max.J，ptc-Gal4/+；puc E69/UAS-c Myc1，UAS-d Max）。而单独过表达d Max不能激活puc表达（G，ptc-Gal4/+；puc E69/UAS-d Max）。(https://www.daowen.com)
为了进一步确认这个位点对于转录促进的重要性，我们又将3个E-box位点附近1kb区域克隆出来，连接到p GL3-hsp70荧光素报告载体中，在瞬时转染c Myc1与HA-d Max后进行了双荧光素酶报告实验（dual-luciferase assay）。结果显示与ChIP结果相同的是，只有最后一个片段（puc-3）能够很强地激活荧光素酶的表达（图7-6 C）。
以上实验结果表明Myc/Max能够直接结合在位于puc的第3个内含子中的E-box区域，进而激活puc的转录。
与此相符的是，我们体内肿瘤迁移结果进一步表明过表达d Myc对lgl-Ras产生的侵袭抑制效果能够被同时去除一份内源性的puc所反转（reverted）（图7-6 D—G），表明Myc是通过puc调控了体内肿瘤侵袭的发生。
图7-6 Myc/Max能直接促进puc的转录（见彩图16）
（A）puc基因座示意图。黑色表示外显子，白框表示5′及3′-UTR，黑色线条表示内含子，红色竖线表示3个可能的Myc/Max结合位点。1，2，3，4，5表示ChIP试验用于检测c Myc1/Max结合的目的片段。puc-1，puc-2，puc-3表示双荧光素酶报告实验中连入pGL3-hsp70荧光素报告载体的片段。
（B）c Myc1/Max能够特异性地结合在puc内含子区域中特定的E-box位点（片段4）。
（C）只有含有puc-3片段的载体在共转了c Myc1/Max后能激活很强的荧光素酶表达。
（D—G）荧光显微镜3龄幼虫眼成虫盘及腹部神经节（VNC）图片，GFP标记克隆。RasV12/lgl-/-诱导的肿瘤细胞侵袭（D′）可被过表达d Myc抑制（F′），这种抑制作用能够被puc的突变体反转（G′）。
（D）y w，ey-Flp/+；tub-Gal80，FRT40A/lgl4FRT40A UAS-Ras V12；Act＞y+＞Gal4，UAS-GFP/+（E）y w，ey-Flp/+；tub-Gal80，FRT40A/lgl4FRT40A UASRas V12；Act＞y+＞Gal4，UAS-GFP/puc E69（F）y w，ey-Flp/+；tub-Gal80，FRT40A/lgl4FRT40A UAS-Ras V12；Act＞y+＞Gal4，UAS-GFP/UAS-d Myc（G）w，ey-Flp/+；tub-Gal80，FRT40A/lgl4FRT40A UAS-Ras V12；Act＞y+＞Gal4，UASGFP/UAS-d Myc puc E69。