卷烟烟气中的有害成分部分有遗传毒性和/或致癌作用，但大多数有害成分的致癌机制不清楚，同时这些化合物还存在一定的交互作用，现行的动物致癌试验评价体系也存在一定的局限，使得卷烟烟气的致癌机理仍不清晰。随着毒性测试策略的转变，基于通路和毒作用模式来研究模式生物的毒理学模型呈现一片繁荣景象。恶性转化实验是模拟致癌物在体内诱发肿瘤的产生，利用培养的哺乳动物细胞暴露外源性化合物后，观察细胞的生长自控能力是否丧失，细胞是否发生恶性转化，进而评价外源性化合物的潜在致癌性。恶性转化试验的观察终点是恶性变细胞，观察细胞生长过程的变化，包括细胞形态、细胞生长力、生化特性、细胞间接触抑制等变化，以及将细胞移植到动物体内能形成肿瘤的能力。转化细胞的鉴定方法包括转化细胞灶计数、凝集试验、软琼脂培养和裸鼠接种等。

恶性转化试验大大缩短了试验周期，也被IARC列为有效的筛选致癌物的评价方法。目前常用的细胞系有叙利亚仓鼠胚胎细胞（SHE细胞）、人纤维细胞、小鼠胚胎成纤维细胞BALB/c 3T3、C3H/10T1/2、BHK-21细胞、经人乳头状病毒HPV-18转染的永生化人支气管上皮细胞BEP-2D等。1984年，IARC、美国国立癌症研究所（National Cancer Institute，NCI）、NIH和EPA联合成立了一工作组，讨论细胞转化的分子和细胞机制，体外细胞转化与体内癌症的生物学相似性以及利用体外转化试验在已建立的细胞系中筛选环境致癌物的可行性。工作组查明了与这些分析有关的方法和技术问题，建立了BALB/c 3T3和C3H/10T1/2两种细胞的恶性转化试验方法，并制定了对形态转化灶进行评分的标准方法^[74]。

当前卷烟烟气的遗传毒性和致癌性评价以短期的体外毒性实验为主，而卷烟烟气的恶性转化试验则可以模拟烟气暴露诱导细胞恶性转化的长期过程，与人类吸烟诱发肿瘤的产生过程更为接近。菲利普·莫里斯公司^[75]采用小鼠胚胎成纤维细胞Bhad 42（v-Haras Transfected BALB/c 3T3）开展卷烟烟气的恶性转化研究。Bhad 42是将v-Haras癌基因转染到BALB/c 3T3细胞中而建立的细胞系，近年来备受关注。该细胞系可以检测致癌物的启动剂和促癌剂，由于Bhad 42细胞传染了ras癌基因而处于肿瘤启动阶段，因此大大缩短了试验周期，也备受众多实验室青睐。Bhad 42细胞反复暴露于TPM，引起Ⅲ型病灶的剂量依赖性增加，中浓度（5～60gTPM/mL）时病灶形成显著增加（高达20倍），峰值为20μg/mL。在三个独立的试验中测试了三批TPM，用0，5，10和20μg TPM/mL计算精密度（重复性和重现性）。重复度和重现性分别为 17.2%和 19.6%，斜率分别为 0.7402 ± 0.1247，0.9347 ± 0.1316和0.8772±0.1767（增加因子mL/mg TPM； x-±SD）；平均斜率的拟合优度（R²）分别为0.9449，0.8198和0.8344。本实验以Bhad 42细胞为试验材料，在致癌（起始和促进）两阶段模式中被认为已经启动，能够以剂量依赖性的方式检测卷烟烟气诱导的细胞转化，具有较高的灵敏度和较高的精密度。由于该方法快速、结果可靠、可用于产品评价，也可用于进一步研究卷烟烟气相关试验物质的非遗传毒性致癌活性。

英美烟草公司以3R4F参比卷烟的气溶胶水提物（Aerosol aqueous extracts，AqE）和TPM进行Bhad 42的恶性转化试验，在CeruleanSM-450直线吸烟机以加拿大深度抽吸模式^[76]（抽吸容量55mL/口，抽吸频率30s，抽吸间隔2s，100%封闭通风孔）抽吸卷烟10口，通过20mL的DMEM/F12培养基，收集不同时间的AqE共3份，测得的烟碱含量为（9.6 ± 0.5）μg/mL，卷烟烟气TPM是在伯格瓦特RM200A转盘吸烟机上以加拿大深度抽吸模式抽吸收集，44mm剑桥滤片上共收集约150mg的总粒相物。0.313%，0.625%，1.25%，2.5%，5%和10%的3R4F AqE进行恶性转化试验，2.5%，5%和10%的3R4F AqE表现出明显的细胞毒性，细胞存活率低于33%，但在进行恶性转化试验时，低剂量的3R4F AqE均不能使Bhad 42发生恶性转化，6，12，24，48，60和120μg/mL的TPM在Bhas启动子细胞转化试验和平行细胞生长试验均呈现阳性，细胞发生恶性转化。3R4F参比卷烟的TPM是一种较强的促癌剂，在剂量范围内均出现阳性，最低浓度可达6μg/mL。

国内的中国人民解放军军事医学科学院也开展了卷烟烟气对BEP2D细胞的恶性转化研究，正常BEP2D细胞仅能在无血清条件下培养，通常在有血清条件下，由于受到血清的诱导分化作用，细胞在含有血清的培养基中总体生长状态明显受到抑制，细胞接种效率低；而转化细胞由于卷烟烟气使细胞的遗传性状发生改变，对血清的分化诱导呈现明显抗性，因而在有血清培养基中可以正常生长。正常细胞在半固体琼脂培养基中不能形成克隆，而肿瘤细胞失去接触抑制，具有锚着独立生长能力，能够在半固体琼脂中形成克隆，因此细胞获得锚着独立性，能在软琼脂质中形成克隆是细胞发生恶性转化的重要标志，也是检测转化细胞和肿瘤生物学特性最常用的方法。根据细胞生长环境改变、锚着独立性生长的特性来检测化合物引起细胞恶性转化的作用，便于观察和判断细胞转化过程的各种生理特性变化。因为血清抗性实验在细胞恶性转化早期过程就可以出现。避免单独应用锚着独立生长实验观察和判断细胞恶性转化的单一性，同时也避免过多的传代、长时间培养所带来的繁重工作量及易污染的弊端^[77，78]。研究发现，第70代，即P70的BEP2D细胞成功实现了恶性转化，核因子κB抑制蛋白E抗体（Inhibitor Of Nuclear Factor Kappa-B Kinase Subunit Epsilon，IKBKE）出现表达升高现象，利用慢病毒si RNA敲减IKBKE后发现，细胞增殖、细胞克隆形成和细胞凋亡显著降低，证实了IKBKE在CSC诱导的支气管上皮细胞恶性转化中担任关键作用。Western blot检测结果发现敲减IKBKE能降低STAT3磷酸化水平。这提示CSC诱导细胞恶性转化过程中IKBKE参与了对STAT3通路的调控。进一步研究利用STAT3 通路激动剂IL-6和IKBKE si RNA共同作用P70细胞，结果显示，IL-6显著阻滞了敲减IKBKE对细胞增殖、克隆形成和凋亡的影响，证实了支气管上皮恶性转化过程中IKBKE对STAT3通路的调控作用^[79]。

川北医学院^[80]采用2μg/L的卷烟烟气提取物对人支气管上皮细胞16HBE进行恶性诱导，每代细胞暴露24～48h，连续暴露50代，细胞发生恶性转化，恶性转化细胞命名为16HBE-M，后将16HBE-M传代10代。恶性转化细胞的裸鼠成瘤试验和瘤体的Ki67^[2]的免疫组织化学检测来验证恶性转化细胞模型的建立。

皮下成瘤试验是以1 × 10⁶个细胞/只裸鼠，将16HBE-C（16HBE对照细胞）和16HBE-M细胞分别注射于BALB/c裸鼠左右侧前肢腋下，动物正常饲养，从第6天开始，每天测量1次肿瘤长径（b）和短径（a），计算肿瘤体积，肿瘤体积（mm³）=1/2ba²，第16天给予安乐死，剥离肿瘤，称重。所有脏器和肿瘤组织以4%多聚甲醛固定，HE染色病理观察。经过16d，比较16HBE-C和 16HBE-M细胞的裸鼠成瘤瘤体，发现16HBE-M形成的肿瘤增长速度以及所形成肿瘤体积和质量均大于16HBE对照细胞（16HBE-C）（图2.4）。(www.daowen.com)

图2.4 CSE诱导16HBE细胞恶性转化细胞模型的建立^[80]

（1）裸鼠注射16HBE-C和16HBE-M细胞16d后，成瘤瘤体的比较；（2）从第6d开始测量瘤体的长径和短径，计算其肿瘤体积（mm³），∗∗表示与16HBE-C组比较，P≤0.01；（3）16HBE-C和16HBE-M细胞裸鼠肿瘤质量比较，∗∗表示与16HBE-C组比较，P≤0.01

并采用Ki67作为验证细胞增殖能力的指标^[81]，对肿瘤组织中Ki67进行免疫组织化学检测，发现16HBE-M细胞形成肿瘤组织中的Ki67阳性细胞高于16HBE-C（图2.5）。研究通过对16HBE-M的长链非编码RNA（long non-coding RNA，lncRNA）差异表达分析，筛选出了高表达的长链非编码RNA——linc00152，并发现在CSE引起人支气管上皮细胞16HBE恶性转化过程中，linc00152参与调控细胞黏附和间质化等恶性表型的改变，继而影响16HBE-M细胞在体内的转移。

图2.5 肿瘤组织的免疫组织化学检测^[80]

（1）HE染色的病理切片观察（400×）；（2）反映细胞增殖能力的Ki67免疫组化观察，DAB染色（400×）