红罗宾石楠组培苗玻璃化控制及其挽救的研究初探
红罗宾石楠组培苗玻璃化控制及其挽救的研究初探
董静 顾巧英 邵方均
(上海市农工商现代农业园区开发有限公司 上海201423)
［摘 要］本文就减少红罗宾石楠组培继代过程中玻璃化苗比例，通过对其再生过程中发生玻璃化现象的几个关键因子的调整以达到控制玻璃化的发生。同时对已产生的大量玻璃苗进行挽救的问题进行了初步探讨。试验表明:培养基在pH值6.0～6.2，琼脂粉强度1100克/平方厘米，激素浓度为BA1.0毫克/升+KT0.1毫克/升+ NAA0.1毫克/升时红罗宾石楠组培苗的玻璃化比例相对较低，且增殖比例适宜;在增殖培养基中若出现玻璃苗，应尽早转接到MS空白培养基中延长培养，可以挽救50%的玻璃苗。
［关键词］红罗宾石楠;组织培养;玻璃化;控制及挽救
玻璃化现象(vitrification)是试管苗呈水晶半透明状，叶片像开水烫过一样呈水渍状，叶片增厚且易脆，叶表面缺少角质层或蜡质而发育不全，外观形态表现异常，是植物组织培养过程中经常遇到的一种现象。在我们多年组织培养生产的非洲菊、芦笋、芦荟、红叶石楠等组培苗中经常出现，特别是在红罗宾石楠组培初期继代生产过程中玻璃化苗的比例有时可高达60～70%。大量玻璃苗的出现阻碍了组培苗工厂化生产的速度，而且玻璃化苗难以诱导生根，移栽不能成活，造成人、财、物的极大浪费。因此在如何减少玻璃苗及如何挽救已经出现玻璃化现象的组培苗，笔者从琼脂强度、培养基的pH值和激素浓度等几个关键因子变化的影响方面，探讨了控制玻璃化苗的方法及玻璃化苗的挽救措施。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1试验材料
于2004年从美国进口红罗宾(RedRobin)红叶石楠植株上采取植株茎尖。
1.1.2试验试剂
6－BA、KT、IBA均购自上海稼丰园艺用品有限公司，为美国进口BR级;
强度为900克/平方厘米的琼脂粉购自上海稼丰园艺用品有限公司，进口BR级;
强度为1100克/平方厘米和强度为1200克/平方厘米的琼脂粉购自厦门星隆达化学试剂有限公司，日本进口Biotech Grade级。
1.2方法
不同强度琼脂粉对增殖系数和玻璃化苗的影响。在MS+6－BA2.0毫克/升+KT0.1毫克/升+NAA0.1毫克/升培养基中分别添加3种强度分别为900，1100，1200克/平方厘米的琼脂粉，将增殖生长正常的幼苗转接到上述3种培养基中，研究不同强度琼脂粉对增殖系数和玻璃化苗的影响。
pH值对玻璃化苗的影响。在MS+6－BA2.0毫克/升+KT0.1毫克/升+NAA0.1毫克/升培养基中添加0.1摩尔/升NaOH调节pH值为5.8～6.0，6.0～6.2，6.2～6.4，将生长正常的红罗宾石楠增殖苗转接到以上3种培养基中，研究pH值对玻璃化苗的影响。
不同激素配比对红叶石楠增殖系数及玻璃化的影响。选取没有玻璃化的增殖苗接种到含0.5，0.8，1.0，1.3，1.5毫克/升6－BA，0.1毫克/升KT，0.1毫克/升NAA不同激素配比的增殖培养基中进行增殖培养，研究不同激素配比对红叶石楠增殖系数及玻璃化的影响。
对玻璃化苗的挽救在增殖的前几代，由于玻璃化苗比例很高，为挽救玻璃化苗，将转接在增殖培养基中培养15d，20天和30天的玻璃化苗转入MS空白培养基中(不加激素)继续培养30天后观察组培苗的长势。
上述所有培养基均用MS基本培养基，加入0.45%琼脂粉、3%白砂糖，pH6.0，培养时间均为30天;培养瓶使用的均为无色透明玻璃瓶，封口是用的上海稼丰园艺用品有限公司生产的带透气孔膜的塑料瓶盖;培养条件为光照强度1500～2000lx，温度23℃～25℃，光照时间12小时/天。
2结果与分析
2.1不同强度琼脂粉对增殖系数和玻璃化苗的影响
从表1可以看出:使用琼脂粉强度为1100和1200克/平方厘米的培养基玻璃化苗比例相对较低。其中琼脂粉强度为1100克/平方厘米的培养基中试管苗增殖系数相对较高，同时培养基软硬适中。而琼脂粉强度为1200克/平方厘米的培养基过硬，因此，琼脂粉强度为1100克/平方厘米的培养基比较合适。
表1 不同强度琼脂粉对红叶石楠红罗宾幼苗增殖系数和玻璃化的影响
2.2pH值对玻璃化苗的影响
由表2可以看出，pH值在6.0～6.2、6.2－6.4的培养基中玻璃化苗较少，在5.8～6.0时玻璃化苗明显增加。但pH值在6.2～6.4的培养基偏硬，增殖苗的系数减小，因此适合红罗宾石楠的培养基pH值为6.0～6.2适宜。
表2 培养基中不同pH值对红叶石楠红罗宾幼苗玻璃化苗的影响
续表
2.3不同激素配比对红叶石楠增殖系数及玻璃化苗的影响
如表3所示:6－BA1.0毫克/升与KT0.1毫克/升和NAA0.1毫克/升配比的培养基中，玻璃化苗相对较少，增殖分化率适宜，最适合红叶石楠红罗宾的增殖快繁。而6－BA0.1，0.5毫克/升与KT0.1毫克/升和NAA0.1毫克/升配比的培养基中，玻璃化苗很少、但增殖分化的苗很少;6－BA2.0，1.5毫克/升与KT0.1毫克/升和NAA0.1毫克/升配比的培养基中，玻璃化苗很多、增殖分化的苗多，但增殖苗矮小。综合以上研究结果表明:红罗宾石楠的最佳增殖培养基为MS+6－BA1.0毫克/升+KT0.1毫克/升+NAA0.1毫克/升，培养基pH值6.0～6.2，琼脂粉强度1100克/厘米，增殖效果好且玻璃化苗少。且通过几代继代繁殖后玻璃化苗也逐渐减少。
表3 不同激素处理对玻璃化的影响
2.4对玻璃化苗的挽救
从表4可以看出:在MS空白培养基中，可以使一部分玻璃化苗转化为正常苗。但其中一部分玻璃化程度很高的苗(整株茎叶全部透明的苗)就不能转化。说明在玻璃化苗刚出现时就应该及时转接挽救，等到茎段内的组织也完全玻璃化的时候则无法挽救。
表4 MS空白培养基中培养不同时间对玻璃化苗的影响
3讨论
植物组织培养过程中玻璃化现象是植物的一种特有的生理变态现象，因此，材料种类、培养基成分和培养条件如:光照、温度、湿度、pH值等各种内外因素都影响玻璃苗的发生。
玻璃苗有一个明显的表现症状就是叶片水分含量很高，因此我们从减少培养瓶内相对湿度角度考虑，就选用了几种用量相同(均为4.5克/升)的不同强度的琼脂粉，来改变培养基凝固后的水分状况，结果表明强度为1100克/平方厘米、1200克/平方厘米的琼脂粉配成的培养基中玻璃化苗比例减少，这与王艳、曾幼玲等人在油菜试管苗上通过提高琼脂浓度来减少玻璃化的结果一致。可是琼脂粉强度过大会导致增殖苗的增殖比例下降。就这一点在我们组培生产过程中通过改善培养环境延长培养时间而使增殖率得到了提高。同时改变封口膜的通透性减少瓶内湿度可以减少玻璃化苗的比例，所以我们所有封口材料都使用了有透气孔膜的瓶盖。
在离体培养中，培养基的pH值对试管苗的玻璃化有较大影响，通过培养基的pH值梯度试验发现，偏酸的培养基中玻璃化苗的比例很高，因此适当的pH值是影响玻璃化苗的一个重要因素。不过偏高的pH值会导致培养基过硬，影响组培苗对培养基中营养的吸收。
许多报告指出，培养基中外源细胞分裂素供应过多容易导致试管苗玻璃化，但应注意相配合的琼脂浓度及生长素的相互作用。NAA供应过量也会诱导玻璃化，这种作用可能是通过过量NAA诱导了培养物细胞分裂素的驯化从而导致内源细胞分裂素过高而发生的。在本实验中我们注重了在NAA水平相同的前提下6－BA浓度的调整，然而NAA的浓度是否适宜以及6－BA、NAA交互作用问题有待进一步的研究。
考虑到外源激素对组培苗玻璃化有影响，我们就采用了不加外源激素的MS培养基改善培养环境，在有外源激素培养的组培苗出现玻璃化的不同时间转接到MS空白培养基，进行延长培养挽救刚出现玻璃化现象的组培苗，恢复正常效果明显，尤其是对不易获得的材料和生产实际显得很必要。
目前对组织培养玻璃化现象的发生规律和机理还缺乏真正的了解。梁海曼等人认为，微繁殖中试管苗的玻璃化现象实际上主要是适应性的生理问题。Leshem和Sachs指出玻璃化是生长因子不平衡的产物。因此，在生产实际过程中，在吸收前人研究成果的基础上，进行必要的个别关键因子的平衡实验以控制试管苗的玻璃化现象无疑是有积极意义。
参考文献
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现代农业的发展离不开农业产业化经营，农业产业化经营过程中需要大量资本投资农业。
社会民间资本是最具生命力的资本要素，并且逐步成为农业投资的主体。
社会民间资本参与农业产业化经营必须得到国家和全社会的呵护与支持。
社会民间资本参与农业产业化经营必须建立在依托科技的基础上，走科学发展道路。
减量化(Reduce)原则要求减少投入品数量，从而可直接降低成本。循环型农业在保证不降低产出的情况下，通过提高技术效率(从而有效提高投入品的利用效率)来减少投入品的使用量。
再利用(Reuse)原则要求对废弃物进行综合利用。通过对农业生产与加工废弃物的资源化利用，将废弃物污染转化为资源，不仅可降低污染，而且拓宽了资源渠道，对废弃物的利用其实是延长了产业链，提高了资源利用的附加值。
再循环(Recycle)原则要求对可再生资源进行反复使用。循环型农业注重投入品和生产加工过程的优质化和无害化，有利于降低农产品有害物质的残留、提高农产品质量。