2.4.4　溶原性

2.4.4　溶原性

早在20世纪20年代就有人发现某些细菌品系能抵御噬菌体的感染，而它本身却能引起和它在一起培养的敏感菌溶裂，这种菌称为“溶原菌”。溶原菌对同一品系菌株的溶菌有免疫作用，而它的溶原性（lysogeny）则反映了它以某种方式携带了噬菌体。当非溶原性细菌被溶原性细菌释放的噬菌体感染后，有少数细菌并没有被溶裂，而是转变成为溶原性细菌。当时不少科学家认为这种溶原性起因于某些品系的细菌细胞吸附了一些噬菌体，只要不断地纯化，溶原性也就不存在了。这种看法一直延续到40年代，包括德尔布吕克在内的噬菌体遗传学家都不认为溶原性是一种值得注意的特殊现象。把溶原性作为严肃的科学问题重新提出来的是利沃夫（A.Lwoff）。

20世纪40年代中期，利沃夫以巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）为实验材料深入研究了溶原菌。他在显微镜下追踪观察一代又一代巨大芽孢杆菌的溶原性细菌的培养物。细胞每分裂一次，他就把一对子细胞分开，把其中的一个留起来培养，而让另一个继续生长和分裂，一旦其完成分裂又取一个子细胞留起来培养，让剩下的一个进入生长周期，这样一共连续观察了19个世代，得到了代表19个世代的培养物。检验结果表明这19个世代的培养物都是溶原性的，但又都不存在游离的噬菌体。他的结论是：溶原性并不是一种污染或吸附，而是在没有游离噬菌体的情况下，能通过细菌增殖而代代相传的一种遗传性状。

在一次实验中，利沃夫偶尔发现有个培养物中的细菌发生了自溶现象。把发生了自发溶裂的细菌培养液接种到敏感菌平板，培养皿上出现了噬菌斑。这表明自溶过程导致了游离噬菌体的释放。定量检测表明，每次自溶过程释放的噬菌体数为100～200个，相当于一个烈性噬菌体感染的细菌溶裂所释放的游离噬菌体总数。

在实验研究的基础上，利沃夫提出了下列假设：溶原性细菌品系的每个细胞都携带一个能世代相传的非感染性因子。这种因子偶尔会通过某种方式，引起细胞自溶而释放出具有感染力的噬菌体。他把这种因子称为原噬菌体（prophage）。他力图解决的问题是，不表现出感染力的原噬菌体究竟是如何产生有感染力的噬菌体的呢？他认为溶原性细菌自溶是受某种环境因素影响的。他和他的学生西莫诺维奇（L.Siminovitch）和吉德伽特（N.Kjedgaard）用各种理化因素处理溶原性细胞，终于发现紫外线和某些化学物质能诱导溶原性细胞群体中大多数细胞溶裂，从而释出大量有感染力的噬菌体。

他们的工作使我们看到了一种新的噬菌体，它和烈性噬菌体不同，它能以原噬菌体的形式存在于细菌细胞内，使细胞获得溶原性，以及对同种噬菌体的免疫性（注意：由原噬菌体的存在而产生的免疫性和由细菌细胞表面噬菌体附着位点的结构变异而引起的抗性是本质不同的两件事），这种噬菌体称为温和噬菌体（temperate phage）。温和噬菌体及其寄主细胞的生活周期如图2-21所示。

现在要研究的问题是原噬菌体的本质是什么？溶原化的遗传基础是什么？诱导实验表明溶原菌具有产生完整的有感染力的噬菌体的潜能，所以原噬菌体应该携有完整的噬菌体基因组。那么，原噬菌体基因组的携带者原噬菌体又是以什么方式存在于寄主细胞呢？是游离的细胞质因子，还是以某种方式与细菌的染色体相连的呢？1951年，E.莱德伯格证实了J.莱德伯格和塔特姆用于细菌重组实验的大肠杆菌K12是一个溶原性品系，即携有温和噬菌体λ的原噬菌体。不久，他们实验室就开始以λ噬菌体和寄主细胞染色体的关系作为研究原噬菌体本质的突破口。实验研究的内容可归纳为三个方面。

1.杂交实验用　溶原性细菌和非溶原性细菌做了4组杂交实验。

（1）F＋（λˉ）× Fˉ（λ＋）→溶原性和非溶原性两种重组体出现频率相同。

（2）F＋（λ＋）× Fˉ（λˉ）→不产生溶原性重组体。

（3）Hfr（λˉ）×Fˉ（λ＋）→产生溶原性重组体。

（4）Hfr（λ）× Fˉ（λˉ）→不产生溶原性重组体。

2.涂布实验　用杂交实验中（3）和（4）两组的培养液分别在敏感菌平板上做涂布实验。结果（3）组的培养液涂布后不出现噬菌斑，而取（4）组的培养液涂布后则出现了由游离的λ噬菌体感染并溶裂敏感菌所形成的噬菌斑。

3.基因定位　用杂交法测定λ原噬菌体在寄主细胞基因组中的位置：

两组实验均以Met、Leu、Tyr作为选择性标志基因，以Gal作为非选择性标志基因。

从这一系列实验可以得出下列结论。

（1）在溶原性细菌中，由于原噬菌体的存在而出现某种能抑制原噬菌体复制的物质。同时，这种物质也抑制外来的同种噬菌体的复制和增殖，从而获得对同种噬菌体超感的免疫性。

（2）非溶原性细菌由于没有原噬菌体而不存在抑制物质。因此，当溶原性细菌的原噬菌体在杂交过程中进入非溶原性受体细胞时，会进入复制、增殖和溶裂周期而释放出有感染力的游离噬菌体。这种现象称为接合诱导（zygotic induction）。

（3）在杂交实验中λ原噬菌体也是一个标志基因，它是位于Gal基因附近的。

上述结论在解释J.莱德伯格等所做的杂交、涂布和基因定位等实验结果的同时，又提出了两个新的问题。①抑制原噬菌体复制的抑制物究竟是由λ噬菌体的基因组编码的，还是由寄主细胞基因组编码的？②原噬菌体是以怎样的状态位于Gal基因附近的，究竟是附着于染色体上，还是整合于染色体内？

对于第一个问题，可以这样考虑：如果抑制物是由寄主细胞的基因组编码的，那么在非溶原菌细胞中也应存在抑制物而成为对溶原菌有免疫性的细菌。但大量的实验研究表明不存在有免疫力的非溶原菌，这是可以假设抑制物由λ噬菌体基因组编码的一个实验佐证。第二个实验佐证来自λ噬菌体的突变研究。有一种λ噬菌体的突变体，它感染敏感菌后形成的噬菌斑是清晰透亮的，称为c突变。相应的野生型噬菌体c＋产生的噬菌斑是混浊的，这种混浊起因于被λ溶原化的细菌的二级生长在噬菌斑内形成的小菌落。c突变实际上是溶原化性状的一种突变。凯泽（A.Kaiser）详细分析了c突变，并根据功能互补实验把c突变分归三个顺反子：cⅠ、cⅡ和cⅢ，其中以cⅠ与噬菌体引起寄主细胞非溶原化的关系最为密切。如用λ（c＋）和λ（cⅠ）同时感染敏感细胞，会出现λ（c＋）噬菌体和λ（cⅠ）噬菌体双重溶原化现象，表明c＋对cⅠ呈显性。由此可以推测与cⅠ基因相对应的野生型基因cⅠ＋编码某种抑制物的合成，而cⅠ突变型噬菌体则不能编码有活性的抑制物，因而失去了使寄主细胞溶原化的能力。诱导因素的作用就是破坏或钝化cⅠ蛋白对λ噬菌体复制和增殖的抑制活性，致使原噬菌体重新游离于细菌染色体而进入营养期，随之引起寄主细胞溶裂。关于λ噬菌体的cⅠ蛋白和其他调控蛋白的作用，还将在有关基因功能表达调控的章节中进一步讨论。

关于原噬菌体和寄主染色体的关系，已在分子水平上得到阐明。根据桑格等的报道，λ噬菌体的DNA有48 498个碱基对，末端有12个碱基对组成的黏性末端，可以进行环状和线性结构的互变（图2-22）。当DNA进入寄主细胞后，线状的DNA分子会通过两端黏性末端的互补而形成环状分子，随后通过A.坎贝尔模型整合于细菌染色体的一定位置。整合的位置由DNA和细菌染色体DNA之间特定的同源配对序列来确定。有人曾经分离到λ的一种缺失突变体，这种突变使λ失去了和寄主细胞染色体配对的同源序列，因而丧失了整合的能力和使寄主细胞溶原化的能力。遗传分析还证实，整合所需要的酶是由λ基因组中的基因int编码的。整合后λDNA上某些基因的间距和整合部位两侧寄主染色体基因的间距会发生相应的改变（图2-23），这也是λ原噬菌体不是吸附而是整合于寄主细胞染色体的重要佐证。

与性因子F一样，λ的整合和游离也是可逆的，也会以一定的概率出现差错。类似F′那样的λ-Gal也已被发现，这就是发生频率极高的局限性转导现象。