7.3.1　插入序列

插入序列（insertion sequence，IS）最先是在大肠杆菌的半乳糖操纵子（gal）中发现的。半乳糖操纵子是编码与乳糖代谢有关的几种酶的基因集合，它包括紧密连锁的结构基因E（编码透性酶）、T（编码转移酶）和K（编码激酶），以及一个正向控制的操纵基因O。起初有人发现了一种很特别的半乳糖激酶缺陷型细菌，这种突变型细菌发生突变的位置，可以在半乳糖操纵子的任何部位，时而在编码激酶的基因内，时而又在另外两个结构基因内，甚至还可位于操纵基因内。遗传分析表明半乳糖操纵子中的基因次序为：5′-O-E-TK-3′。实验结果证实在突变型细菌的半乳糖操纵子中所有处于“突变点”的转录下游的结构基因都会因突变而丧失功能，故这种突变被称为极性突变。这类突变有两点值得注意：①所有这类突变都能回复到野生型，所以不可能是缺失突变；②这类突变向野生型的回复概率不会因任何诱变剂的处理而增加，所以它既不是碱基替代突变，也不是移码突变。那么，一个突变既不是点突变又不是缺失突变，它又能是什么性质的突变呢？让我们用分子遗传学的方法来分析一下。

用符号galm代表半乳糖操纵子中的这个突变，用噬菌体λ做溶原性转导，分离得到这个极性突变的DNA片段，用λdgalm表示。然后，在含放射性元素的无细胞合成系统中，转录出具有放射活性的λdgalm mRNA片段。分子杂交实验表明，这段放射性mRNA的其中一段核苷酸序列能和极性突变型细菌的DNA形成双链，但是它不能和野生型细菌的DNA的相应片段杂合。这说明突变型的半乳糖操纵子中有一段额外的、在野生型半乳糖操纵子中没有的DNA序列。进一步的研究表明λdgalm mRNA还能和多种极性突变型细菌的半乳糖操纵子段DNA杂合，只是形成杂交分子段的位置不相同，也就是说同样结构的DNA序列插入了半乳糖操纵子不同位置。如果将来自极性突变菌的λdgalm和来自野生型菌的λdgal＋的DNA双链分别热变性后，再放在一起复性，就可以在电子显微镜照片中看到两者形成的λdgalm/λdgal＋杂合分子（图7-6a），从照片中可以看到杂合分子的某个部位，有一小段突出的单链侧环，这就是λdgalm存在着一个额外片段的又一证据。如果在制作电镜样本时，加入一个标出分子长度的标志分子，就可以量出这段插入半乳糖操纵子的DNA片段的长度约为800个核苷酸对，现在已精确测定其长度为768个核苷酸对。

归纳起来，大肠杆菌半乳糖操纵子的极性突变实际上是在操纵子的某一位置插入了一段额外的长度为768 bp的DNA片段，这种插入序列的嵌入不但使它所插嵌的目标基因失活，也影响插入位点转录下游的各个结构基因的表达。现已发现的这类插入序列至少有7种，长度都在1 000 bp左右。如IS1：768 bp；IS2：1 327 bp；IS4：1 428 bp；IS5：1 195 bp；IS903：1 057 bp。

还有一个问题是插入序列插入目标基因的方向问题。DNA双链分子的两条链上的碱基是互补但不是一样的。如果让一个DNA双链分子解链变性然后超速分离，就可以把两条互补链分开，根据它们的比重不同，可将两条链分为重链和轻链。退火复性时，只有重链和轻链相互形成互补双链，而两条重链或两条轻链因碱基序列相同而不能形成互补的双链分子。然而，当我们把不同的极性突变菌的λdgalm的两条重链或两条轻链退火后混合复性，就会在电镜照片上发现一种形状奇特的杂合分子，它有一小段双链区，还拖着四条单链尾巴（图7-7），这表明这两个极性突变菌株的IS1插入方向是相反的。

我们还可以把不同的IS DNA分离出来，制备成放射性标记的探针，用来探测大肠杆菌的环状染色体。这样就会发现野生型细菌的DNA分子上原来也有8个IS序列，其中5个是IS2序列，另外3个是其他插入序列。在F质粒、R质粒的环状DNA上也有不同数量的插入序列。所以，我们在不同的IS突变菌中，发现插入序列出现于同一基因的不同部位或者不同的基因，说明IS的确是会跳跃转移，并且具有在寄主细胞基因组的不同位置插入DNA分子的能动因子。

不同的插入序列结构不同，功能也不完全一样。例如，IS2比IS1长559 bp，两者的生物学功能也不尽相同。前面曾提及IS1插入大肠杆菌基因组的方向可以是相反的，作用却都是抑制目标基因功能的表达。IS2插入寄主细胞基因组的方向也可以是相反的，但插入方向不同的IS2作用是不完全一样的，它会因插入方向的不同，抑制或促进目标基因及其邻近基因的表达。有人曾测定过在抑制或者促进基因表达的情况下，目标基因及其邻近基因的mRNA和蛋白产物确实发生了变化。这就暗喻IS2很可能隐含了一段与调节RNA聚合酶功能有关联的特定序列，譬如，当IS2以顺方向插入时起促进子或启动子的作用，以反方向插入时起某种终止信号序列的作用。

关于插入序列还有一点要说明的是，DNA片段的迁徙转移和所有的生命活动一样是一个酶促反应。研究表明，一些DNA重组缺陷突变型细胞（recAˉ，recBˉ，recCˉ等）仍有IS插入突变发生。所以，有理由认为催化IS插入的重组酶系和同源DNA的重组酶系是不尽相同的。对插入序列的核苷酸序列分析表明，每个插入序列的两端都有反向重复序列（inverted repeat sequences，IR），这无疑是IS插入或脱离寄主细胞基因组的重要结构基础之一（图7-8）。

毫无疑问我们对插入序列的认识还有待于深入，但是我们可以认为所谓的IS突变，很可能是IS由于某种原因插进了某个在正常情况下不该插入的位置而造成的异常结果。而正是自然界的这种“异常”为我们打开了一条认识IS的小路，使我们有可能借此来认识正常情况下IS的功能和它的生物学意义。我们还将结合转座子来深入讨论插入序列的作用。