3　标本制作

3　标本制作

由于石蜡切片的过程较复杂，各个环节之间的关系密切，往往因为一个环节不注意，就会导致切片制作的失败。现将其过程按先后次序排列如下：

取材→洗涤→固定（抽气）→洗净→脱水→透明→浸蜡（透蜡）及包埋→切片→粘（贴）片→脱蜡（溶蜡）→染色→脱水→封固→标签。下面将各个环节简要介绍一下。

（1）取材

要根据切片要求进行取材，要选择健康的、标准的材料。采下的标本，不要碰伤或变干，应将它放在标本箱内，或插在盛水瓶中，也可用湿的布或纸包起来带到实验室进行处理。如果切片内容是根的初生构造，那要将采来的材料进行洗涤，把泥土洗净，但洗涤时不要损伤根毛。然后把根的根毛区切下来放在装有固定液的小指管中去，其长度在5毫米左右。有的叶片较大，则取有主脉和侧脉的一段作横切。有的叶片很长，如水稻、小麦的叶，取材时应取叶片中间部分。茎的取材不能太粗，通常在直径2毫米以内较妥，草本植物的茎可以适当粗一点。如要观察水稻、小麦茎的基本构造，取材时要取节间中央的部分，不要取在节上及其附近的节间部分。茎的长度可为2～10毫米的小段。有的材料较粗，可切成1/2或1/4大小的小块。总之，切片用的材料大小要适当，通常以不超过0.5～1立方厘米为宜。将切好的材料放在固定液中固定。固定液与材料体积的比为20∶1。

（2）固定及抽气

①固定液的要求。在切取新鲜的动植物组织之后，如不迅速进行适当的处理，就会有收缩、干枯与变形现象。因此要把动、植物组织中的细胞很快杀死及固定，使它们不致于在死亡前形态及结构上有更多的变化，基本上保持活体原有的状态。这种固定方法多用固定剂来处理，其中大致包含下列几种作用：a.杀死原生质，保持或固定原来微细结构。b.凝固组织中的某些部分，使材料适当的硬化，便于切片。c.使增加折光力与染色力。d.固定后又能具有保存材料的作用。

②固定剂的种类及配制。固定剂的种类很多，但它们渗入组织的速度都比较缓慢。现将一些固定剂渗入组织的速度见表15-2。

苦味酸（三硝基苯酚）：是一种极毒的黄色结晶，极易爆炸，通常配成饱和水溶液贮存。其在水中的溶解度为0.9％～1.2％，在酒精、苯、氯仿中溶解度略高一些。它作为固定液，对于组织渗透缓慢，但能使组织强烈收缩，能使蛋白质、核酸沉淀，对脂类并无作用，并能防止组织过度硬化，增进染色能力。用此液固定过的材料不必用水洗，可用70％酒精冲洗。

铬酸（H2CrO4）：是三氧化铬的水溶液。其结晶体容易潮解，因此容器一定要密封。它溶于水，不溶于酒精。固定液常配成0.5％～1％的浓度。平时配成2％或10％的母液，用时可稀释成各种浓度。铬酸是一种强氧化剂，如还原为氧化铬（Cr2O3）时，便失去固定作用。它不能与还原剂酒精、甲醛（福尔马林）等混合贮备。用铬酸固定材料时，不能直接暴露在阳光下，这样容易引起已固定的蛋白质分解。铬酸对脂肪无作用。经铬酸固定的材料容易收缩，但硬化程度不增加，固定后的材料必须用水冲洗24小时，否则影响组织染色。

福尔马林：单独作固定液的浓度在2％～10％之间。它不能凝固核蛋白，但能保存脂类物，可用于高尔基体及线粒体的固定。材料经福尔马林固定后，可增加组织的硬化程度。经脱水后材料有显著的收缩现象。固定材料的细胞用碱性染料染色比酸性染料好。

醋酸（乙酸）：纯醋酸在16.7℃以下的温度就成冰状固体，故名冰醋酸。它可与水、酒精混合。它不能凝固细胞质中的蛋白质，但能凝固核内的核蛋白。它穿透组织能力强，用它固定的材料，可以使细胞膨胀，防止收缩。由于它不能凝固细胞中的蛋白质，组织不会硬化，因此常和洒精、福尔马林、铬酸等引起组织变硬和收缩的液体混合便用。

酒精：市场上有两种酒精，纯酒精和95％的酒精，固定材料用的浓度以70％较好。高浓度的酒精固定材料，使组织收缩变硬。它可以凝固蛋白质，但不能沉淀核蛋白，因此，对核的染色就很难了。酒精能溶解大部分脂类，所以，要研究细胞中含类脂物就不能用此液固定。酒精很易被氧化成乙醛，甚至变成醋酸。它不能与氧化剂——铬酸、重铬酸钾、锇酸等配合使用。固定剂还有很多种，但有的价格昂贵，有的有剧毒（如锇酸、氯化汞等），不经常用的固定剂这里就不介绍了。

在固定材料时，可以用一种固定液，如用70％酒精，3％～5％福尔马林，3％醋酸，还有升汞，锇酸等。多数情况下，是用几种固定剂以不同的比例配制成的混合固定液，常见的有以下几种：

a.福尔马林—醋酸—酒精（它们第一字母各为F、A、A，故叫FAA）。

此液作为组织固定较好，细胞学上的效果就会差些。由于材料性质不同，3者间的浓度比例可以变化。如固定木材等可略减冰醋酸，略增福尔马林；如易收缩的材料，可稍增冰醋酸；用于胚胎材料的固定可以改用为50％酒精89毫升，福尔马林5毫升，冰醋酸6毫升。此混合固定液不仅是固定剂，同时也是一种良好的保存剂。平时固定2-24小时，时间更长一些也无妨。固定后的材料不必洗涤，可直接放到70％的酒精中脱水。

b.酒精—醋酸—氯仿固定液（卡诺氏液），有以下两种配法：

a：纯酒精15毫升，冰醋酸5毫升。

b：纯酒精30毫升，冰醋酸1毫升，氯仿30毫升。

这两种固定液渗透力强，适用于植物幼嫩部分及动物组织，它的固定效果良好，根尖与花药只需固定30～60分钟，通常固定时间不要超过一天。

c.铬酸—醋酸固定液：铬酸1克，冰醋酸1毫升，蒸馏水100毫升。

此固定液用于易渗透的材料，如丝状藻类、菌类、蕨类的原叶体等，固定时间12～24小时，并在流水中冲洗12～24小时。

d.铬酸—醋酸—福尔马林固定液（又称纳瓦兴氏固定液）。

纳瓦兴氏固定液在植物制片上被广泛地应用，是一种优良的固定液。它有多种配制方法，但两类固定液中有还原剂与氧化剂，因此，不能预先混合贮存。通常配成甲、乙两种液，并分别贮存，用时将两液等量混合，固定时间为12～48小时，固定后在70％酒精中洗涤数次，然后脱水。固定液配量方法很多，根据材料和要求可以选择配制适当的固定液。

③抽气。将材料放在固定液中固定，由于材料中，特别是植物的根、茎、叶、果皮等组织内含有空气，材料要浮在上面，而影响固定液渗透到组织内部，因此在固定时必须抽气。常用的抽气方法可用吸滤原理将盛有材料及固定液的小玻管（指管）放在过滤瓶中，打开自来水龙头进行抽气（如图15-4）。也可以将材料与固定液一并倒入10毫升大小的注射器中，抽几次后材料便可下沉。假如材料多，体积又略大一些，有条件的话可用真空泵抽气。抽气前固定液不易装得太满，但也不要太少，同时不适合抽得太快，否则组织容易受损，或将材料抽出瓶子外面。在抽气时能看到材料上连续冒出一个一个的小气泡。待小气泡没有了就可以停止抽气，材料便沉入固定液中。通常抽气后再换一次固定液。假如此固定液也可做保存液用，那就用此种固定液作为保存液，如FAA固定液可以作保存液。有的固定液不能作保存液，因此，抽气后的材料要放在70％酒精中，以便保存较长时间而不使材料受到影响。

固定液以新配为好，配好的固定液要放在阴凉处，避免日光直晒，配好后马上贴上标签，用铅笔或绘图黑墨水书写，注明固定液名称及配制日期。

（3）冲洗与脱水

材料从固定液中取出后要冲洗，将固定液全部冲洗掉后才能脱水。

①冲洗。用冲洗液冲洗固定过的材料，必须注意固定液的性质，如用铬酸—醋酸固定液固定过的材料须在流水中冲洗，而且冲洗时间较长。如用FAA固定液固定的材料可直接在50％或70％的酒精中洗涤。用水冲洗的方法通常将固定液倒掉，材料移入指管，将指管口用1～2层纱布和橡皮圈扎牢，倒放在贮水的水槽内。这样使指管一半沉在水中，一半露在水面。自来水龙头用橡皮管直通水槽。打开自来水龙头（不要将龙头开得太大），经流水冲洗12～24小时后，就能够达到冲洗的目的。

假如要用酒精作为冲洗剂比较简单，材料从固定液取出后，可将它放在装有适度酒精的小瓶中，通常材料与酒精的比例为1∶10，洗涤时间与次数可视材料大小、质地性质而定，开始几次换洗时间每次要30分钟左右，以后几次可延长到1～3小时，最后用70％酒精保存过夜。

②脱水。脱水是制片中一个很重要的环节，在这个过程中要把组织中的水分完全除去，使组织变硬，便于透明与石蜡的浸入，否则会失败。

a.脱水剂：脱水剂分为很多种类，有酒精（乙醇），丙酮，正丁醇等，但比较便宜而又容易得到的是酒精，所以酒精作为最常用的脱水剂而被广泛使用。在脱水前要把酒精配成各种浓度贮备在瓶子里，在瓶子外面贴上标签，注明酒精的浓度和配制时间，并用瓶塞塞紧。它的浓度分35％、50％、70％、80％、95％、100％几级。通常用市场上购置的95％酒精配制，这比用纯酒精配制价格便宜。各级酒精的配制方法有多种，但比较简便两种方法是：一种方法见第2页，另一种简便方法是：设原有酒精浓度为A，所需要的酒精浓度为B。则：取B毫升原有酒精，加上A—B毫升的蒸馏水，即可获得A毫升的B％浓度的酒精。如用95％酒精配制成35％的浓度，即用35毫升的95％酒精＋60毫升（即95—35）的蒸馏水而得。

b.脱水时间与步骤：一般脱水可从35％的酒精开始，若用50％酒精洗涤固定过的材料，脱水可从50％酒精开始，在70％、80％、95％、100％酒精中逐级上升脱水。材料在每级酒精中停留时间视材料大小、质地、温度及固定液的性质来定。如洋葱、蚕豆等根尖每级酒精中停留30～60分钟，但若用苦味酸固定则须延长1小时。由FAA固定的草本茎每级停留2小时，木本茎，则要停留4小时，较大的木本茎每级应延长为8～12小时。一般材料小于2立方毫米每级在2～4小时。动物组织如小白鼠的肾脏，其厚度为2～4毫米，每级停留1～2小时。已切好的片子在染色缸脱水时，每级停留3～20分钟。

在95％和100％的酒精中，放置时间不能过长，因为这样容易使材料变脆，影响切片，如果白天不能脱水结束，可将材料放在70％的酒精中过夜。从95％酒精移入纯酒精时，瓶口上的塞子也应更换干燥的，以免有水分渗入。

（4）透明

材料在酒精中脱水后，要经过透明剂透明，才能浸蜡。这个环节使材料中的酒精等被透明剂所代替，使石蜡能顺利地进入材料的组织之中，以便切片。透明剂的种类很多，常用的主要有二甲苯、苯、氯仿等。

二甲苯为最常见的透明剂，溶于酒精。它具有透明力强的优点，为石蜡溶剂，但不溶于水。如材料在二甲苯中停留太长，会收缩变脆变硬。一般从纯酒精移入二甲苯，要经过等量的纯酒精二甲苯，这样就可以避免材料收缩变脆，以及在纯酒精中脱不净水的弊病。材料在二甲苯中不宜放置过长，切片前的材料约经1～3小时，但要视材料的大小和性质而定。染色后的制片一般经过5～10分钟即可。材料到二甲苯中，可以更换1～2次，大的材料要多更换一次，但停留在二甲苯中的时间总的不超过3小时。从纯酒精中取出材料放到二甲苯中去，如果材料的组织中有极微量的水分，二甲苯就不能进到组织中去，石蜡也不能进去，切片时形成空洞。同时在组织表面出现乳白色的云雾状，这样做出的片子也不是很好。

二甲苯极易挥发，瓶子与染色缸都要盖好盖子。在空气中湿度大时，染色缸盖子边缘要涂抹少许凡士林，防止大气中水分渗入。二甲苯经用过一段时间后，假如用1～2滴石蜡油滴入，便出现白色云雾状，这说明二甲苯中有水分，不能再用。

若材料放到二甲苯中出现白色云雾状，这说明材料未脱净水，必须将材料倒回到等量的纯酒精二甲苯液中，然后再放到纯酒精中脱水，纯酒精可以再换一次。然后再回到等量的纯酒精二甲苯溶液中去，最后直到二甲苯中透明。在等量酒精二甲苯中时，用少许番红干粉末投入使材料着色，便于材料包埋在白色石蜡中后，容易辨别，切片时容易掌握材料的方向。

用过的70％以上的酒精及二甲苯，各自另盛容器，不要倒掉，经回收后仍可再用。

（5）浸蜡与包埋

浸蜡过程是使石蜡溶于透明剂中，慢慢浸入材料组织的细胞中，要以石蜡完全代替二甲苯，以便切片。

①石蜡。它是常用的包埋剂，其熔点在50℃～60℃之间。植物材料用熔点54℃～58℃的石蜡，动物材料用熔点52℃～56℃的石蜡，但还要看材料的质地及季节等。如材料较硬的用硬的蜡，材料较软的用软的蜡，切片薄的用较硬的蜡，夏天气温高用熔点较高的蜡，冬天气温低用熔点较低的蜡。

市场上购置的石蜡含有灰尘、水分及挥发性物质等，假如不经过处理就用于材料的浸蜡及包埋，必然会导致切片的制作失败。处理方法有几种，常用的方法之一，就是将石蜡放在干净的容器中，加热到熔解成液体并冒白烟止（切忌温度过高而燃烧），此时便减低火力，继续半小时左右，稍冷却一下，将石蜡用滤纸过滤，过滤下来的石蜡放在容器中。冬天过滤时，石蜡因温度低而在滤纸上凝结，因此在过滤时，将容器放在砂盘里，砂盘放在电炉上加热，由于砂受温度的影响，使容器周围温度升高，达到石蜡在滤纸上熔化，而不凝结，使石蜡能较顺利地过滤下去。另一种方法是将石蜡熔化后倒入容器中，放在温暖处徐徐冷却，这能使石蜡中的灰尘等杂质颗粒沉下去，待石蜡表面已凝结时，便将上面的石蜡倒在另一容器中，将下面沉淀的杂质留下来，也可以再熔化过滤。用上述两种方法所取得的石蜡较纯，贮藏在容器中，用盖子或纱布盖好，防止尘埃等落下。

②浸蜡方法。用刀将熔点50℃～54℃的石蜡切成小薄片，然后在盛有材料及透明剂的玻璃指管内放入一条纸带，把蜡片轻轻投入，塞紧木塞，放在浸蜡箱或恒温箱小，温度保持在35℃～37℃，待蜡熔解后再加，直至石蜡与透明剂各占一半为止。6小时以后（时间长一些也无妨），打开木塞放到56℃恒温箱中，或有自控装置的浸蜡箱中，让透明剂慢慢蒸发，使蜡的浓度慢慢变大。在56℃的恒温箱中停留2～4小时，要换1～2次纯蜡。在换纯蜡时，先在恒温箱或浸蜡箱中放3个小瓷杯（编为1，2，3号），内盛52℃～54℃或54℃～56℃的纯石蜡。材料从透明剂石蜡混合液中取出后，立即投入1号纯石蜡的小瓷杯中，过一小时后取出材料再投入2号纯石蜡的小瓷杯中，甚至可移到3号纯石蜡的小瓷杯中去，使留在组织内的透明剂全部被石蜡所代替，便可包埋。在取出材料时所用的镊子要放在恒温箱或浸蜡箱内，否则易导致镊子头上的石蜡遇冷而凝固，给操作带来不便。

浸蜡箱（如图15-5）的制作：用木料做成两段的一个木箱子，长31～33厘米，宽25厘米，前面高18厘米左右，后面高23厘米左右，成一斜面，并装上玻璃，能看到里面。内装3只40瓦或60瓦灯泡（前面装两只，后面装一只），各由一个开关控制。箱中央横放一个铅丝格网，上面可放瓷盘，内放浸蜡材料、纯石蜡等。箱上面装有温度计（如用导电表联接电子继电器，可以自动控制箱内的温度），并用开关对3个电灯开与关进行调节。

石蜡浸入动物组织的方法略有不同，材料自透明剂取出后，首先应放在透明剂石蜡等量的混合液中约20～30分钟，然后放入纯石蜡中，换新鲜石蜡一次。总的石蜡透入时间约1～2个小时，换浸纯蜡的方法与植物材料相同，但每次的时间只要30分钟左右，时间不宜过长。

在浸蜡的过程中温度不宜太高，只要保持比石蜡熔化的温度高2℃左右即可。温度过高或忽低忽高，都要影响材料的变化，过高的温度往往引起组织变硬、变脆和收缩，影响切片质量。

③包埋。上面被石蜡浸透的组织连同熔化的石蜡，一起倒入一定形状的容器中（通常用纸盒），立即投入冷水中，使它立刻凝固成蜡块。

a.纸盒制作：用较硬而又光滑的纸折成（如画报纸），其大小按材料大小及多少所需而定。折叠方法见图（15-6）所示，先将1—1折向右，2—2折向左（如图15-6的a、b），然后3—3、4—4上下折叠（如图15-6的a、c），再按图（15-6的d）将两边拉出，接着将两边反折之内（如图15-6的e），再将两端向上下反折（如图15-6的f），捏住两端稍用力拉出即成纸盒（如图15-6的g）。

b.包埋过程：在小烧杯中准备已熔化的纯石蜡，放在恒温箱或熔蜡箱中。准备半脸盆自来水，酒精灯，解剖针，并用铅笔在纸盒一端写上标本名称和时间，或写成小纸条放在纸盒一侧。准备好后，将熔化的石蜡连同材料一起倒在纸盒内（此时也可先将纸盒放在烫片台上，保持一定的温度），然后从恒温箱或熔蜡箱中取出镊子与解剖针，迅速将材料按需要的切面及材料之间的间隔排列整齐（如图15-7）。如果镊子及解剖针尖的石蜡凝固起来，就放在酒精灯上熔掉，否则影响操作。包埋时假如熔溶的纯石蜡不够，可用恒温箱或熔蜡箱中备用的纯石蜡。包埋的手续要迅速，包埋好了，立即用两手的拇指、食指各捏住纸盒突起来的两端，平稳地放入脸盆中的冷水里，用嘴向纸盒的熔蜡表面吹气，使其表面很快凝固。放入水中时，千万不要一下就放到水下面，这样容易使蜡及材料由于水的冲击力量而溢出，或形成一个洞。应将纸盒平稳地放在水面上，待纸盒中的石蜡表面凝固了，便可将纸盒一侧倾斜，使冷水从纸盒一侧进入，然后立即使它沉入水中，使纸盒中的石蜡迅速凝固。45分钟左右，从水中取出纸盒晾干，拿出蜡块材料登记本，登记后把纸袋（或蜡块）放在一定的地方备用，纸袋或容器都要注明材料的名称、日期等，以防混淆。

（6）切片

包埋后便可切片，切片前要作各种准备。

①切片机。一般用转动式切片机，它是一种较精密的机械装置（切片机的种类较多，这里不一一介绍）。转动式切片机的夹物装置能上下移动，也可前可后推进。而夹刀的装置则是固定不动的（如图15-8），它的夹物装置后连接着控制切片厚度的微动装置，即厚度调节器。夹刀部在切片机的前面，其刀口与夹物装置上的组织块垂直。当手轮摇动一次，夹物装置的水平圆柱体也随着上下来回移动一次。向下移动经过刀口，组织块便被切去一薄片，然后向上移动，经过刀口后，就按所调节好的切片厚度，厚度调节器以水平方向将组织块向前推动所需的厚度，这样连续摇切，石蜡块就被切成连续的蜡带，最薄可切成2微米。有些切片机有冷冻装置的附件，根据需要装上附件，便可做冷冻切片。

②切片刀。要把材料切成薄片，切片刀是很重要的，一般一台切片机附有两把切片刀。买来的切片刀上涂上防腐剂，并用油纸包好，切片前，取出切片刀，除去防腐剂（用废二甲苯也可），装嵌在刀夹内（刀夹与刀要固定不要调动），装上刀柄，进行磨刀。要将刀磨出锋口来。磨好的刀经过一段时间切片，特别是切坚硬的材料后，容易变钝，因此要经常磨刀。

磨刀石：用质地均匀、平滑无疵的黄石、青石以及油石均可。磨刀时，在磨石上滴上润滑剂——水或中性肥皂或液体石蜡等。磨过刀后的磨石放在一定的地方，并用纸将它盖起来，以防灰尘等粘上。

磨刀的方法：先除去刀及磨石上灰尘等杂物，在刀上涂润滑剂，将刀口在磨石上向前及稍向左推动，待推到磨刀石另一端时，便将刀反转（时刀背仍按在磨石上），刀口朝人身体方向由左稍向右拉回，翻转时用手腕的力。这样反复进行（如图15-9），使刀刃锋利为止。在磨石上磨好后，可在用皮革制的刀皮上刀。刀背向前向右方向，反转后仍然是刀背向前稍向右拉回（如图15-10）。在刀时可用水和中性肥皂，还可用石蜡，油滴在刀皮上作润滑剂。

③石蜡块固着。转动切片机，附有固定石蜡块用的圆形金属小盘，但只有2个。因此还须准备大小不同的小木块（1厘米×2厘米、2厘米×2厘米、2厘米×3厘米）（如图15-11a），并在木块一个面浅割成方形网状的小格子。先在金属小盘上或小木块上涂上厚厚一层熔蜡，然后将埋有材料的蜡块按切片要求切成一定大小，用很薄的金属片加热后放在金属小盘的蜡上，左手将蜡块一边放在金属片上，待蜡块下面呈熔溶状态后，抽出金属，蜡块便牢牢粘在金属小盘（或小木块）的蜡上，冷却后用解剖刀将材料四周多余的蜡切去（要把蜡块粘在金属小盘或木块的中间），并用刀修整成正方形或略带长方形，上下两条边要平行。左右边也要注意平行（图15-11b、c）。这样在切片时就能使切成的蜡带成一直线。要不然，蜡带就弯曲，造成制片上的困难。

④切片的方法。先将修整好的蜡块（粘在金属小盘上或木块上）装在切片机的夹物装置中，拧紧螺旋。然后装上切片刀，刀口朝上，使材料切面与刀口平行，注意不可超过刀口。材料的纵轴必须与刀口垂直，否则切片不正。根据需要调整厚度调节器，通常植物切片的厚度为8～12微米，动物组织切片可薄一些。切片时右手握住切片机手轮柄，转动一圈便可切下一片，切片粘在刀口上，第二片切下来时与第一片连起来，第三片与第二片连起来，这样便形成一条蜡带。在切片时左手拿着毛笔把蜡带轻轻托住，右手徐徐地转动手轮，这就能切成一条很长的蜡带。待蜡带20～30厘米长时，将蜡带轻轻放在衬有黑蜡光纸的盆内或木板上，光面朝下。注意不要受风吹，否则蜡带会被吹掉或吹乱。

在切片时常出现一些毛病，如不能切成蜡带，切片卷起来，切片破碎，切片有一条裂缝等。出现这些弊病的原因是多方面的，但往往与刀口不够锋利，刀的角度不当，蜡块的上下边不平行，甚至与刀口缺刻等都有关系，也有的与前面几个步骤有关，这些都要经过反复实践方能掌握。切片结束后，应将切片机、切片用具擦拭干净，盖上罩子或放在切片机箱内。切片刀要取下擦干净放在刀盒内。

（7）粘片、烫片及烘片

用切片机切成的蜡带经显微镜或放大镜检查，符合要求的就可以用于粘片。

①玻片的清洗。把切下来的蜡带一小段粘贴在载玻片上之前，先要清洗载玻片（包括封片用的盖玻片）。新买来的载玻片与盖玻片先放在玻璃缸（或其他容器）内，倒入2％的盐酸酒精（95％酒精100份加盐酸2份），泡浸4～6小时，再用流水冲洗干净，取出放在95％酒精中备用。陈旧或不适用的切片标本，其载玻片、盖玻片经处理后仍可用。处理方法是先放在肥皂水中煮沸10～15分钟后，再用热水洗去残留的树胶等，然后用清水冲洗，放在清洁剂中浸30分钟，然后取出后用自来水把清洁剂冲洗干净，再用蒸馏水洗净。最后放到95％酒精中浸几分钟，取出用干净纱布擦干备用。或用洗涤液浸泡一夜，取出用自来水冲洗，然后用蒸馏水洗一次，泡浸在95％的酒精中，用前取出擦干（洗涤液配制：重铬酸钾20克，水100毫升，浓硫酸100毫升。先将重铬酸钾溶解于水，然后将硫酸一滴一滴加入。切忌将水加入硫酸中。配好后盛在有玻璃塞的玻璃容器中，以防氧化，可反复使用到变成蓝黑色为止）。盖玻片很薄，擦拭方法与徒手切片等节相同。

②粘贴剂。粘贴剂种类很多，配方也不尽相同，不同的材料与不同的要求，可有不同的粘贴剂配方。但通常用得比较广泛、制作比较简便的是一种蛋白甘油粘贴剂，对动、植物粘片均适宜。

制备方法：将一个鸡蛋打入小烧杯中，取出蛋黄，留下蛋白，用玻棒充分调打，可以看到很多泡沫。然后用粗滤纸或双层纱布过滤到量筒内，所得滤液为透明蛋白液，再加入等量的甘油，稍稍摇动使其混合，然后再加入防腐剂，可保存数月不变质。防腐剂通常用麝香草酚（1∶100），效果较好。将配好的蛋白粘贴剂倒入洗净的玻璃小口瓶，并备小玻棒一支，瓶口用一个球形中空的玻璃罩套下。天热时，将粘贴剂放在冰箱中保存，可用数月之久。

另一种是明胶粘贴剂，也是被广泛应用的一种粘贴剂，对单细胞藻类及花粉的粘附效果较好。其配方是：明胶（粉状）1克，蒸馏水100毫升，石炭酸2克，甘油15毫升。

在烧杯中倒入蒸馏水100克，放在酒精灯上加热，当水温在36℃时，将明胶粉末缓缓地倒进烧杯中，待完全溶解后，再加入2克石炭酸结晶与15毫升甘油。用玻棒搅拌使其完全溶解，然后过滤，贮存于玻璃瓶中，并用玻璃塞把瓶口塞紧。

除了粘贴剂外，还须用干净的瓶准备蒸馏水，或3％福尔马林溶液。每个瓶中备有专用的吸管一支。

③粘贴方法。左手取干净玻片，滴上一滴粘贴剂，用右手小指在载玻片上将粘贴剂均匀地涂一层（范围不要太大，也不可太厚），再用吸管滴上几滴3％福尔马林溶液（或蒸馏水）。

用解剖刀将蜡带切成许多小段，每段的长短，应视盖玻片的长度为准，一般应比盖玻片短约～。然后用镊子将小段蜡带放在福尔马林溶液（或水）上，有光亮的一面朝下，没有光亮的一面朝上。蜡带应放在载玻片中心偏左的位置，以便在靠载玻片右边贴标签。假如载玻片上水分不足，可以适量加上去。

④烫片。通过上面处理的载玻片平稳地拿到烫片台（如图15-12）上，烫片台可以自己制作，主要由三个部分组成，上面是一块较厚而又平滑的金属板（铜板最好，其他金属板也可以），正方形、长方形均可以，长31～33厘米，宽31厘米，高13厘米。中间是一个用金属做成方形或长方形的水箱，里面可以装水，把金属板盖在水箱上，下面支持架高14厘米。金属板上一侧有一个圆形的小洞，可以嵌插温度计。水箱放在一个四只脚的金属架子上。为了使水箱水的温度上升，可用酒精灯、电炉在水箱下面加热，温度保持在35℃左右，浮在水（或3％福尔马林液）上的切片受热后，慢慢伸展。等它完全伸展后，用解剖针摆正切片在载玻片上的位置，用吸水纸吸干多余的水，或将载玻片倾斜把水倒掉，但要注意不要移动蜡带位置。

⑤烘片。等载玻片上的水干后，就可以收集起来，两片两片背靠背地放在一个由金属制成的烘片架上，每个烘片架有十多个插片销（如图15-13）每一个销中可以放两片载玻片。两片贴紧的面是不粘贴切片的面。在架上应贴上标签，注明切片名称、时间等。放在30℃左右的温箱中24小时，加速干燥，等干燥后，将载玻片取出，放在切片盒中，并写好标签备用。

（8）脱蜡　粘贴在载玻片上的切片，经烘干后进行脱蜡，就是要把包埋材料外面及渗透到组织中的石蜡溶解掉。脱蜡剂最常用的是二甲苯与苯。将切片放在二甲苯中10～20分钟，等石蜡溶解后再移到等量的二甲苯纯酒精混合液中，有时也可直接从二甲苯脱蜡后放到纯酒精中去，然后经纯酒精到各级浓度的酒精，再到染色液中进行染色。

（9）染色　为使组织及细胞各部分能够清楚地显示，应采用不同的染料染不同的部分，或者使某些部分染上色而使其背景不染色，这样使组织及细胞的结构在光学显微镜下能很好地显示出来。

①染色剂。染色剂种类很多，有天然的也有人工的染料，有酸性的也有碱性的染料，细胞中的酸性部分易被碱性染料染色（如细胞核中的染色质是酸性的，易被碱性染料染色），而细胞质是碱性的，易被酸性染料染色。以下是几种经常用到的染色剂。

苏木精：是由苏木枝干中浸提出来的一种色素，对细胞核的染色特别好。配制好后要放一段时间让它氧化成苏木精素后方可用于染色。常用金属盐作媒染剂（如硫酸铝铵、铁矾等），可以增加染色效果。

番红：碱性染料，溶于水（4.5％），酒精（3.7％）（15℃），一般用作细胞核的染色剂。用0.5％～1.0％的酒精溶液（酒精用50％或70％的浓度），对高等植物中木质化细胞及角质化细胞的染色都较好。

固绿：酸性染料，在水中溶解度为4％，而酒精中可达9％，常配成0.5％～1.0％酒精溶液（用95％的酒精配制而成）。常与番红作对染。

碱性品红：是细胞核的染色剂，常作组织化学染色——孚尔根反应中希夫试剂的主要成分。

酸性品红：一般用在动物学上制片染色，能溶于水，略溶于酒精。

甲基绿：碱性染料，易溶于水（8％），稍溶于酒精（3％），为核的染色剂，常与酸性品红作木质部的染色。

桔红G：是衬染细胞质的染料，常与苏木精、番红、龙胆紫一起应用，此染料易溶解于水（8％），不溶解于纯酒精，常将染料溶于丁香油的饱和溶液用作染色——分色剂，在番红、固绿对染后，迅速以此染料复染，可得理想的分色效果。

用于生物制片中的染色剂达百余种以上，这里不一一介绍。

②染色剂的配制方法。以下是几种常用染色剂的配制方法。

a.海登汉氏铁矾苏木精：

甲液（媒染剂）：铁铵矾（或铁明矾——即硫酸铁铵）2～4克，蒸馏水100毫升。将铁铵矾放入蒸馏水中使其溶解后用黑纸包好，保存在冰箱中，以防止沉积物出现在瓶壁上。

乙液（染液）：10％苏木精酒精溶液5毫升，蒸馏水100毫升。

注意点：甲液必须在用时配制，这样才能保持新鲜。铁明矾应为紫色结晶，若为黄色即不能用。如需配成永久贮藏液可按下列配方配制：铁明矾（紫色结晶）15克，硫酸0.6毫升，冰醋酸5毫升，蒸馏水500毫升。

乙液在使用前6周配制，将0.5克苏木精溶解于5毫升95％或纯酒精，置于玻璃瓶中，让它充分氧化。用时再加100毫升蒸馏水。此液配好后，可保存3～6个月，但不能与甲液混合，否则易变坏。即使在应用时，甲乙两液也不能混合。

b.德拉菲氏苏木精。

c.酸酒精：70％酒精100毫升，浓盐酸1毫升。

d.番红液。

e.固绿液。

f.结晶紫溶液：结晶紫1克，水100毫升。

e.桔红G溶液：将桔红G慢慢加入丁香油中，使成饱和液。

③染色程序：动植物材料不同，染色的要求不同，因此其染色程序也有不同，但说蜡染色到封固基本上有很多共同之处，现举例说明：

a.番红—固绿对染法：高等植物的根、茎、叶等组织切片，常用番红—固绿二重染色。其步骤如下：烘干的石蜡切片放在二甲苯中脱蜡（天冷脱蜡慢，可将切片用酒精灯微微加温后，再放到盛有二甲苯的染色缸中）5～10分钟（由材料的厚薄与室内温度决定在二甲苯中停留多长时间）→等量二甲苯纯酒精液中5～10分钟→100％酒精5～10分钟→95％酒精5～10分钟→85％酒精5～10分钟→75％酒精5～10分钟→50％酒精5～10分钟，然后在番红染液中染色12～24小时，取出放在50％酒精3～5分钟→70％酒精3～5分钟→85％酒精3～5分钟，再将经番红液染过色的切片放在固绿染液中复染3分钟（或用滴管滴在载玻片的材料上染色）。然后将切片放在95％酒精中2～3分钟→纯酒精（I）1分钟→纯酒精（Ⅱ）1～3分钟→等量纯酒精二甲苯液5分钟→二甲苯（I）2～3分钟→二甲苯（Ⅱ）3～5分钟，取出后马上滴上一滴国产中性树胶。树胶不要太多，太多易溢出盖玻片，如溢出，可用纱布蘸少量二甲苯擦掉，或在干后用刀刮去。树胶太少了也不好，应马上在一侧加树胶。用镊子钳住盖玻片（要选择大小合适的盖玻片）一侧，轻轻地放下，尽量不使气泡产生，并在右边贴上标签，注明切片名称、切片方向、染色、制作日期，然后放在切片木盒里。切片一定要放平，不然树胶会流动而使切片材料移位。将切片盒纵的竖起来放（如图15-14），这样切片便成平放状态。待干燥后可以把切片盒平放。现将切片脱蜡到封片全过程用图表示（如图15-15）。做好的切片放在干燥通风的地方，贮藏在切片柜内，使用时切忌让切片曝晒在阳光下，因这样易使切片颜色褪掉。

番红—固绿染色结果：细胞核红色，细胞质绿色，木质化细胞壁红色，纤维素细胞壁绿色。

b.铁矾苏木精染色法：切片脱蜡后经各级酒精下降到蒸馏水中→4％铁矾中煤染20～30分钟→流水中洗涤15分钟→蒸馏水中（更换3～5次）→0.5％苏木精染液中染色2～5小时→水中洗去多余的染料→2％铁矾或苦味酸中分色（以其颜色分化为灰色为止）→流水中充分洗涤1小时左右→50％酒精→70％酒精→80％酒精（以上各级酒精中5～10分钟）→95％酒精3～5分钟→纯酒精（I）0.5～2分钟→纯酒精（Ⅱ）1～3分钟→等量纯酒精二甲苯液3～5分钟→二甲苯（Ⅰ）2～3分钟→二甲苯（Ⅱ）3～5分钟→用中性树胶封固。

如果需要复染，可以在脱水至50％酒精时，用l％番红染液衬染2～24小时。到纯酒精（Ⅱ）后，再用丁香油→桔红G滴染分色1～5秒钟。

此染色法对细胞分裂时期的染色较好。细胞核中的染色体被染成蓝黑色，并可长期保存不褪色，细胞的其他部分也被衬托得很清晰。

现在对此方法有了改进，方法较简便，效果也很好。切片在蒸馏水中洗净后，不经过4％铁矾的媒染剂，直接投入非常稀的苏木精染液中（在染色缸中盛满蒸馏水，然后滴上0.5％苏木精染液3～5滴）。将切片在此稀染液中浸12～24小时，然后用蒸馏水洗，并很快地经过一次2％的铁矾分色，再用流水洗净，经各级酒精脱水。在脱水至50％酒精时用1％的番红染液衬染2～24小时，到纯酒精（Ⅱ）时再用丁香—桔红G分色1～5秒钟。

c.番红—结晶紫—桔红G三重染色法：此染色法对分生组织染色分明，效果较好，但要用纳瓦兴等含有铬酸的固定液固定的材料较好。其脱蜡脱水染色的步骤如下：

切片脱蜡后经各级酒精至70％酒精（各级酒精时间5～10分钟）→1％番红溶液（用70％酒精配制）染色12～24小时→50％酒精5分钟→30％酒精5分钟→水洗干净→1％结晶紫水溶液中15～60分钟→水洗后用吸水纸吸去水分→30％酒精→50％酒精→70％酒精→85％酒精（以上各级酒精各5～10分钟）→95％酒精3～5分钟→纯酒精（1）2～3分钟→纯酒精（Ⅱ）2～3分钟→桔红G溶液（丁香油饱和液）滴染1～5秒钟→等量纯酒精二甲苯液3～5分钟→二甲苯（Ⅰ）2～5分钟→二甲苯（Ⅱ）2～3分钟→封固。经过三重染色，染色体被染成红色，前期核的染色质被染成紫色，核仁淡红色，质体与纺锤丝紫色，细胞质淡黄灰色。

（10）封固

封固是永久制片的最后一个环节，使已经染色与透明过的材料保存在适当的封固剂中，能使材料长期保存不坏。同时要求封固剂有一定的折光率，这样才能使材料封固后能在显微镜下清晰显示出来。

①封固剂。下列几种是常用的封固剂。

a.加拿大树胶：它是由生长在加拿大的一种胶冷杉所分泌的物质提炼而成的固体树脂，呈黄色，溶于二甲苯、氯仿中，调制成适当的浓度（将块状树胶打成小碎块，放在二甲苯中，用玻棒进行搅拌，其浓度为玻棒一端形成小滴滴下，而不形成细丝为佳）。它的折光率为1.524，与玻璃的折光率1.51很接近。

配制好的加拿大树胶放在干净的树胶瓶中（如图15-16），这种瓶呈圆锥形，并有一底部呈圆形中空的瓶口罩，用这个玻璃瓶口罩，罩在瓶口上。并配上一根小玻棒（封固时滴树胶用），此玻棒不能太长，刚好从树胶瓶底到瓶口罩中便行可。盛放树胶的瓶子不能用软木塞和玻璃塞，以免时间久了瓶塞被树胶封固。如遇封固时，滴上少许二甲苯使瓶塞打开，或倒放在装废二甲苯的盘里，过几天就能打开瓶塞。稀释树胶时不能加热，否则会因高温影响而使树胶变质，成为暗黑色。用好后应立即将瓶罩罩好，以免二甲苯蒸发使树胶变稠，以及飞尘落入，并放在光线暗的地方，避免日光直射。树胶长期贮放，能逐渐变为酸性，对已染色的材料会起褪色作用。所以常在树胶瓶中放置豆子大小的大理石碎块，用来逐渐中和树胶的酸性（大理石为碳酸钙，具弱碱性）。应注意的是大理石碎块要先用二甲苯清洗后再放入树胶中。

b.中性树胶：国产中性树胶与加拿大树胶相同，是一种天然树脂，经提炼中和后溶解在二甲苯中成60％浓度，折光率与玻璃近似，干燥后透明无色，能长期保持材料的颜色，可以直接用于封固，效果良好。

②盖玻片。用盖玻片封固，是将石蜡切片制成永久制片的最后一个步骤。盖玻片的厚度为0.13～0.17毫米，种类很多，通常有18×18、22×22、23×32、24×50（毫米）等规格，根据切片要求及材料大小，选择不同规格的盖玻片。新买来的盖玻片也要清洗，经清洗后的盖玻片放在有盖的玻璃器皿中，平时要注意防止尘埃散落，用时将盖打开，取出盖玻片后立即盖好盖子。发霉的盖玻片，要用洗涤液清洗后方可用，经洗涤后仍如果有霉菌存在，那就不能用了。

③封固操作步骤如下。

a.用镊子从二甲苯中取出片子，平放在载玻片偏中心一侧，并用吸水纸吸去载玻片上的余液。

b.左手开启树胶瓶，右手用瓶中玻璃棒蘸取树胶滴在载玻片的材料上，并随手盖好瓶盖。滴树胶的量，应视盖玻片的大小而定，使树胶在盖玻片下刚好布满，不要使它过多或不足。

c.用镊子取出洁净的盖玻片，以一边放在载玻片上滴树胶的位置，然后徐徐放下，使树胶布满于盖玻片与载玻片之间，应该注意的是在此之间产生气泡。一般产生气泡的原因是覆盖盖玻片太快和树胶量不足，或树胶过稠。如有气泡产生，则可以在靠近气泡的一边再补滴树胶一滴，然后轻轻地压盖玻片，使气泡逸出。