7.6 Wnt 经典信号对结核分枝杆菌感染后自噬调控机制
既然自噬通路依据可分为mTOR 依赖和mTOR 非依赖途径，那么结核分枝杆菌感染后诱导的自噬是否依赖于mTOR 途径。为了解决这个问题，我们通过激活和阻断Wnt 经典信号，并检测mTOR 通路中重要的蛋白PI3K、AKT 和mTOR 的mRNA 和蛋白表达水平（图7-10），结果显示Wnt3a 上调了BCG 感染后巨噬细胞内PI3K、AKT 和mTOR 基因的mRNA 和蛋白水平表达量，同时上调了p-AKT 水平。而Wnt 经典信号的抑制剂DKK1 则逆转了这一结果。由此可以看出，Wnt 经典信号对BCG 诱导巨噬细胞自噬的过程的调控可能依赖于mTOR 途径。
图7-10 巨噬细胞内mTOR 通路相关蛋白表达水平
为了进一步证明Wnt/β-catenin 信号通路在调控BCG 诱导巨噬细胞自噬的过程是否依赖于mTOR 途径，可以通过雷帕霉素激活自噬来证实Wnt经典信号对自噬的调整是否依赖于mTOR。哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（Mammalian target of rapamycin，mTOR）是一种丝/苏氨酸蛋白激酶，在细胞生长、增殖、分化、细胞周期调控等多个方面发挥重要作用。近年来发现mTOR 蛋白及其参与的信号通路与细胞自噬发生密切相关。雷帕霉素可以抑制细胞自噬的负调控因子mTOR，因此常被作为自噬的诱导剂能够促进自噬的发生。同时，雷帕霉素还可以通过抑制mTOR 而抑制下游4EBP1 和P70S6K 的磷酸化，导致大量蛋白转录受阻，而抑制效应T 细胞增殖。近年来，雷帕霉素因其毒副作用小并且靶向效果明显，已被作为免疫抑制药物成功应用于器官移植后抗排异反应，以及少数癌症患者的辅助治疗。
通过研究发现，利用Wnt3a 激活Wnt 经典信号后可以下调BCG 感染的巨噬细胞内LC3 的mRNA 及LC3Ⅱ/Ⅰ的蛋白表达量（图7-11），有效抑制了自噬流发生，而加入雷帕霉素后，Wnt3a+BCG 共处理组内LC3 的表达量显著上调，也就是说明雷帕霉素激活了被Wnt 经典信号抑制了的自噬，由此表明Wnt3a 抑制BCG 感染后巨噬细胞发生自噬应该与雷帕霉素的靶蛋白mTOR 有关。同时与结核分枝杆菌感染后的细胞相比，雷帕霉素还激活了被Wnt 经典信号抑制的细胞自噬相关蛋白Atg5、Atg7 和Atg12 的mRNA 和蛋白表达水平，而下调P62 的mRNA 表达量；不仅如此，雷帕霉素还缓解了Wnt3a 抑制BCG 感染后巨噬细胞内自噬其他相关蛋白的表达情况，因此表明Wnt3a 抑制BCG 感染后巨噬细胞自噬体膜的形成与雷帕霉素的靶蛋白mTOR 相关，更进一步证实Wnt3a 抑制BCG 感染后巨噬细胞自噬体膜的形成依赖于mTOR 途径。
图7-11 巨噬细胞内自噬相关基因的蛋白表达水平
细胞之所以维持稳态，因为有多种信号通路参与调控，各个信号通路相互交叉组成一个复杂且精密的网络系统。为了探讨Wnt 经典信号通路在调控细胞自噬过程中依赖于PI3K-AKT-mTOR 通路的具体机制。有研究证实，Wnt 经典信号通路中重要的功能蛋白β-catenin 与AKT、NF-κB、Notch 等多条信号通路相互作用调控细胞活性。AKT 能磷酸化β-catenin 552 位，通过磷酸化作用促进β-catenin 的入核和发挥转录活性。
根据前人报道及本课题组的研究结果，我们将Wnt 经典信号对自噬的调控机制总结如下（图7-12），首先BCG 感染后可诱导巨噬细胞自噬相关蛋白LC3II、Atg5、Atg7 和Atg12 等蛋白的表达量上调，在这些蛋白的作用下双层膜自噬体逐渐形成，之后和溶酶体融合后形成自噬溶酶体从而引发自噬，并且在一定范围内具有BCG 作用时间梯度和浓度梯度的依赖性，而Wnt 经典信号的配体Wnt3a 则能显著抑制BCG 诱导的细胞自噬，这主要是由于Wnt 经典信号可以上调PI3K、AKT 和mTOR 的表达并使其磷酸化，从而激活mTOR 信号通路。同时为了进一步验证Wnt 经典信号对自噬的抑制作用，采用了mTOR 抑制剂雷帕霉素来诱导自噬，发现Wnt 经典信号能有效阻滞雷帕霉素诱发的自噬，由此可见，Wnt 经典信号可以抑制结核分枝杆菌疫苗株BCG 感染后诱发的细胞自噬，并且依赖于mTOR 途径，这些研究结果将为进一步揭示结核病的致病机理和靶向药物研制提供理论依据。
图7-12 Wnt 经典信号对BCG 感染后自噬调控机制