微小RNA与肝癌的相关研究
1. 微小RNA与肝癌发生
细胞增殖与死亡失衡是肿瘤发生的一个重要标志性信号,一般表现为增殖信号被激活和死亡过程受到抑制,致使细胞的生长失控从而导致肿瘤发生。原发性肝癌的发生、发展与癌基因与抑癌基因异常、细胞周期失控等有关。微小RNA在HCC发生过程中,既可通过调节细胞周期或者细胞凋亡,也可经调节抑癌基因或癌基因参与肿瘤发生的途径,影响HCC的发生和发展;其作用具有双向性、网络化及组织特异性的特点。如与肝癌发生密切相关的癌抗原——细胞增殖抗原MKi67,敲除MKi67后肝癌细胞QGY-7703的生长受到抑制,而应用增强型绿色荧光蛋白(EGFP)标记系统研究发现MKi-67是miR-519d的作用靴基因,MKi-67的表达受miR-519d的调控,在肝细胞的恶性转化过程中发挥着抑癌基因的作用。另一典型的肝细胞特异性miR-122a,也为抑癌基因,不但能够负向调控细胞周期蛋白G1表达,从而抑制肝癌细胞增殖,而且还能与硫氧还原蛋白过氧化物酶-2基因的5’-UTR结合,破坏其酶的抗氧化作用,使肝癌细胞生长微环境的形成受到阻碍。
微小RNA能通过多种信号通路途径,在原发性肝癌相关的细胞周期和细胞凋亡的调控中发挥作用。与肝癌组织相比,miR-224在肝癌组织呈过表达,能够有利于凋亡抑制因子-5的转录,使肝癌细胞增殖;miR-29既可通过经典的线粒体凋亡途径,又可经调节凋亡相关蛋白如Mcl-1和Bcl-2等发挥作用促进癌细胞凋亡,在不同生理和病理条件下与肝细胞的恶性转化存在密切的关系。微小RNA可通过细胞周期调节Cyclin蛋白家族、P13K/AKT/mToR信号通路和周期蛋白依赖激酶抑制因子(Cip/Kip)等途径调节细胞的生长,其中miR-26a能直接作用于CyclinD2和E2,使癌细胞生长周期发生阻断;miR-122约占肝微小RNA总量的70%,它可调节细胞周期调节蛋白CyclinG1抑制癌细胞增殖;p27、p21和p57等属于Cip/Kip家族的成员,可调节细胞G1期向S期的转化,影响原发性肝癌细胞增殖分化;miR-221和miR-222可结合于抑癌基因p27的3’-UTR,能促进癌细胞增殖,还能作用于p57,加速S期进程来促进癌细胞的增殖。
酪氨酸激酶受体(MET)在40%~70%原发性肝癌中过表达同时参与细胞侵袭、转移。有文献报道MET转录后受到miR-1和miR-199a的调控。miR-199家族成员在一些研究或报告中发现呈下调趋势,但是一些关于miR-1的研究中并未发现下调,但它通过启动子甲基化在原发性肝癌细胞株和原发肿瘤中沉默,此外miR-1的异位表达可抑制HCC细胞株的细胞周期和诱导细胞凋亡。所以,miR-1基因沉默可能移除了酪氨酸激酶受体过表达造成的限制性因素。
2. 微小RNA与肝癌细胞侵袭和转移
恶性肿瘤最重要最基本的生物学特征是侵袭和转移,也是临床上造成恶性肿瘤患者死亡的最重要原因。近年来,微小RNA在肿瘤的转移和侵袭过程中发挥的作用受到广泛的关注。
Budhu等应用芯片法对241例肝癌组织中微小RNA表达谱进行分析,发现与肝癌转移显著相关的微小RNA有20个,其中miR-211、miR-219-1和miR-338表达上调;而miR- 30c、miR-34a和miR-148a表达下调,此外,与肝癌复发及预后相关的微小RNA有16个。
PI3K-AKT信号通路参与增殖、分化、凋亡和葡萄糖转运等多种细胞功能的调节。当PI3K-AKT信号通路激活后能够活化AKT激酶,目标蛋白磷酸化后可促进细胞的存活,其中肿瘤抑制基因PTEN能够控制该途径。研究发现PTEN是miR-21的靶标基因过表达的miR-21抑制PTEN的功能。miR-21还可以下调肿瘤抑制基因Pdcd4,Pdcd4在诱导凋亡中起一定作用,在肿瘤侵袭血管中起负调节因子作用,对原发性结肠癌的研究中发现Pd-cd4蛋白和miR-21呈负相关,研究转染抗miR-21的RKO细胞株发现Pdcd4蛋白水平增高和侵袭力降低。说明miR-21/Pdcd4的相互作用与肿瘤细胞的侵袭和转移有关。miR-21不但与细胞凋亡密切相关,而且可作用于PTEN基因,介导相关癌细胞侵袭,影响下游基因表达如局部黏着斑激酶及基质金属蛋白酶2(MMP-2)和MMP-9,促进癌细胞侵袭、转移。抑癌基因PTEN是miR-221和miR-222的基因,可调控肝癌细胞转移及TRAIL耐药。miR-122不但能够抑制癌细胞生长,而且还可调控ADAM10和ADAM17抑制肝癌细胞侵袭和转移。研究者发现经典的let-7可调控I型胶原a2表达以抑制癌细胞转移,miR-1、miR-23b、miR-34a、miR-101和miR-199a-3p等可分别经HGF/c-Met、RACL、mToR和FOS等信号通路或调控相关癌基因,使肝癌细胞的侵袭或转移得到抑制。
有学者用半定量PCR和Real time PCR的两步筛选法研究肝癌中微小RNA,发现肝癌中22个微小RNA基因拷贝数发生变化;接着用微小RNA探针法对22个微小RNA检测发现,有13个微小RNA基因的表达水平发生了变化。其中miR-151基因在肝癌中过表达且与肝癌细胞的肝内转移呈正相关性。通过深入研究人们发现miR-151可以促进肝癌细胞的侵袭、迁移与转移,而这种致癌基因的作用是由miR-151-5P所介导而不是miR-151-3P。此外,miR-151可与其宿主基因FAK协同作用激活Cdc42、RhoGTPase、Racl蛋白的活性来促进肝癌的侵袭与转移。
3. 微小RNA与肝癌诊断
目前诊断肝癌主要通过影像学、酶学标志物、蛋白标志物等。由于其存在一定局限性,不能及时确诊,致使肝癌治愈率低、死亡率高。Mitchell等证实了微小RNA广泛存在于健康人和多种病人的血浆和血清中,并且随着人们的生理状况、病理程度和疾病种类的不同,血清和血浆微小RNA中分子的种类和数量也将随之发生改变。此外,研究还发现在血清和血浆微小RNA中通常与蛋白质紧密结合在一起,具有很好的稳定性。这些特点使得血液循环中的微小RNA可能成为诊断肿瘤新生物的标志物。Kota等报道肝脏中有12种微小RNA与肝细胞癌发生过程密切相关,可作为肝细胞癌诊断标准。Yamamoto等研究表明,miR-500在45%的人类肝细胞癌组织和肝癌细胞系中过表达,能够作为肝细胞癌的指标。Qu K Z等发现肝癌患者血清中的miR-16、miR-196、miR-199a、AFP、DCP和AFP-L3六项指标中miR-16和miR-199a显著减低,miR-16单独或联合其他标志物(DCP、AFP和AFP-L3)诊断原发性肝癌特异性为78.5%,敏感度为92.4%,具有很好的应用前景。Sukata T等应用qRT-PCR方法研究发现miR-98、let-7a和let-7f在HCC发生早期显著升高,可以作为HCC早期诊断标志物。Li L M等用芯片方法对48例HCV肝炎、120例HCC患者、135例HBV肝炎和210例对照的血清微小RNA表达谱研究发现,乙型肝炎患者血清中13种微小RNA表达升高,包括miR-10a、miR-23b/a、miR-92a、miR-99a、miR-122a、miR-125b、miR-150、miR-223、miR-342-3p、miR-375、miR-423和let-7c。综合利用此13种微小RNA的表达变化可以用于鉴别乙型肝炎、正常肝细胞和肝癌。其中、miR-375、miR-25和let-7f所组成的诊断标志可以区别乙型肝炎和肝癌,单独应用miR-375诊断肝癌具有最显著意义,敏感度达100%,特异性达96%。目前的研究报告数据显示,众多微小RNA在HCC中都有明显变化,但是其中一些不具有很好的稳定性和重复性,如何筛选出诊断HCC最合适、最稳定的微小RNA或组合是目前研究的热点。
微小RNA表达谱在不同类型的肿瘤中存在着不同的改变,相同肿瘤在不同病理类型、恶性程度、临床分期的表达谱也不同,因此选择一种或多种准确、低廉的检测微小RNA表达谱的方法来确定HCC的临床病理特征,进而对个体化诊断和后续的肝癌个体化治疗方案的选择具有非常重要的意义。目前,检测微小RNA主要依据芯片筛选出发生显著改变的基因,再通过RT-PCR检测方法对其进行验证,确定特定微小RNA的表达量与病理分型、临床分期、转移等与诊断相关的临床病理特征之间的关系。有学者用芯片技术分析肝组织微小RNA的差异,结果发现,miR-30C-1、miR-34a、miR-148a和miR-181等,在肝硬化、慢性肝炎和HCC等组织间具有明显差异。肝癌患者血清中miR-16和miR-199a明显降低。
黄晓卉等采用液相芯片技术同时结合实时定量PCR的方法分析了36例肝癌患者的微小RNA表达情况,发现微小RNA-338-3p表达的下调程度与肿瘤分化程度、肝癌恶性程度、肝内外转移和门静脉癌栓等具有关系,揭示微小RNA-338-3p可用于肝癌诊断的生物学标志物。Gui J等应用微小RNA芯片技术检测肝癌患者血液循环系统中微小RNA的表达时发现,微小RNA-885显著升高,可作为肝癌病变生物学标志。Sukata等应用qRT-PCR方法检测发现微小RNA-98、let-7a和let-7f在肝癌早期呈显著升高,可以作为早期检测肝癌的标志物。Li等对120例HCC患者的血清微小RNA表达谱进行分析发现,微小RNA-375异常表达用其诊断肝癌,特异度和敏感度分别为96%、100%。如果能获得一种微小RNA稳定表达的途径,如血清、血浆等,那么芯片和实时定量PCR技术将因其具有高通量、快速、方便与经济等优点,很可能成为一种大规模用于诊断肿瘤的方法。
4. 微小RNA与肝癌治疗
目前,肝癌的治疗手段主要有手术、放疗、化疗和dc-cik生物免疫细胞治疗。但临床确诊患者多为晚期病人,即使早期确诊患者,也只有一小部分病人适用于肝癌根治性手术治疗。另外,其肝癌传统的化疗药物具有很强的耐药性,对放疗也不是很敏感。此外,肝动脉结扎、肝血管栓塞治疗和注射无水酒精等辅助治疗效果也很有限。因此迫切需要一种新的有效治疗肝癌的方法。
近年来,随着分子生物学的飞速发展,靶向治疗已成为当前的研究热点,而微小RNA能够通过转录后水平对靶基因的表达进行调控,发挥着类似癌基因和抑癌基因的双重作用,对肿瘤的发生进行调控,因此针对微小RNA进行的肿瘤靶向治疗具有很大潜力。Fornari F等发现miR-519d在大多数肝癌中表达上调,能促进细胞增殖和细胞周期的进展,使癌细胞对药物敏感性增加。Xu等研究认为约85.7%的肝癌中miR-195表达下调,同时证明miR-195过表达可以使细胞周期蛋白CDK6、E2F3和D1的沉默。miR-195的过表达,显著抑制了下游靶点E2F的激活和Rb的磷酸化,阻止了G1向S期的过渡。还有研究报道,肝癌细胞转染miR-195后,其集落形成减少,体外的单克隆生长能力减弱,同时体内的成瘤能力也减弱。Xiong Y等利用芯片对微小RNA表达谱研究证实,miR-29在肝癌组织中显著下调,且在各种刺激缺氧、血清饥饿、化疗等方式下诱导的凋亡与miR-29有着重要的关系。Zheng Y等研究发现miR-376a在肝癌中过表达,其不但可以抑制肝癌细胞系增殖,而且还能诱导细胞凋亡。近年来,大量研究表明miR-221在肝癌中上调,可通过抑制凋亡在肝癌发生及药物抵抗中发挥重要的作用,可以通过抑制miR-221的表达来诱导肝癌细胞发生和凋亡。肝脏特异性miR-122在肝癌中下调,细胞周期蛋白G1已经被证实是miR-122的靶标。miR-122能抑制G1蛋白的表达调节细胞周期素G1,同时减少G2/M期,增加P53的转录,使肝癌细胞停留在治疗的致敏阶段。此外,miR-122能通过调节抗凋亡因子Bcl-w的表达来降低细胞的活性,同时激活caspase-3促进癌细胞凋亡。因此,上调miR-122能够促进肝癌细胞凋亡并使其对肿瘤治疗药物致敏。HCC最理想的治疗途径是直接定位作用于参与肿瘤形成的基因。近年来,有报告显示微小RNA用抗寡核苷酸技术(AMOs)抗miR-21转染培养的恶性乳腺癌和胶质瘤细胞可下调miR-21的表达,从而抑制细胞生长和促进细胞凋亡。miR-21在肝外胆管癌过表达,应用AMOs可增加其对化疗药物的敏感性。LNA-修饰的寡核苦酸和胆固醇结合的寡核苷酸在体内均有稳定的抑制微小RNA活性的作用。静脉注射AMOs对肝脏效果明显且持久,所以在临床治疗上有巨大潜力。以上这些研究都显示微小RNA与肿瘤发生和发展有密切的关系,有可能成为治疗肝癌的新方向。