2.3.5 微分离技术
分离技术是改善微流控芯片实验分析性能的重要途径[40]。电泳和色谱分离是实验室和临床应用最多的两种分离手段，以微流控芯片为代表的μTAS快速发展，最初主要得益于毛细管电泳技术在芯片上的成功应用，其高速与高效的分离能力展示了芯片系统的巨大潜力[41]。除了能够进行无机小分子和生物大分子的高分辨分离以外，芯片上还可以实现细胞、细胞病原菌等颗粒物的分离。
2.3.5.1 微流控芯片电泳分离技术
芯片电泳的主要原理是不同质荷比的被分离带电离子(或颗粒)在电泳和电渗流的综合作用下，依据不同的迁移速度而得到分离。
电泳分离是以电场为驱动力，借助离子(或分子)在电迁移或分配行为的差异，对样品进行高效分离的一种技术。微流控芯片电泳以芯片作为其核心部件，通过微加工技术，在硅、石英、玻璃和聚合物等芯片上加工宽度为微米级、长度为厘米级的微通道，并在芯片上集成一定的外部设备(如电源、光学或电学检测器)，形成一个完整的芯片毛细管电泳分析系统。芯片电泳的分离模式有区带电泳、芯片凝胶电泳、等电聚焦、胶束电动色谱、电色谱等。区带电泳是毛细管电泳和芯片电泳分离中最基本、应用最广泛的一种分离模式。
对于包括蛋白和核酸等在内的生物大分子，其质荷比差异小，但是分子尺寸不同，更适合采用微流控芯片凝胶电泳进行分离。微流控芯片凝胶电泳是以凝胶等聚合物为分离介质，利用聚合物的网络结构进行筛分的一种分离模式，小分子自由穿过凝胶体系，生物大分子被凝胶阻碍，不同被分离组分依据尺寸(或形状)差异、迁移速度不同而实现分离。凝胶电泳的筛分介质可以分为凝胶和非胶聚合物溶液两种。通过通道内原位交联聚合来构建聚丙烯酰胺凝胶筛分介质，可用于蛋白、多肽及核酸等生物大分子的分离。与交联聚丙烯酰胺相比，线性聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、聚氧化乙烯等非胶筛分介质可以在芯片外聚合后注入芯片通道，具有制备简单、使用方便、便于更换，进而可以重复使用芯片等特点，可以根据样品特性通过调整筛分介质的浓度和交联度来调整筛分孔穴结构，也可以更为便捷地构建梯度凝胶筛分网络；同时，形成孔穴结构更有利于加快焦耳热的扩散，提高分离效能。在芯片电泳中，通道内壁对蛋白质吸附是需要解决的问题，可以采用牛血清白蛋白以及PDMA等聚合物涂覆芯片通道内壁[42]。本课题组在进行毛细管电泳蛋白分离过程中，引入了部分交联聚丙烯酰胺凝胶，形成的凝胶网络结构介于交联和非交联结构之间，不仅具有筛分分离功能，同时优良的动态涂覆功能可减少蛋白吸附，无须额外进行通道内壁涂覆即可实现蛋白高分辨分离，并且重复性好，有望在芯片电泳中发挥作用[43]。
芯片电泳等电聚焦分离蛋白质原理与常规等电聚焦一样，都是根据蛋白质、肽等两性离子的等电点差异进行分离的电泳方法。在微流控芯片上进行等电聚焦时，将待测物和两性电解质的混合溶液充满微通道，微通道的两端分别浸入酸性缓冲液和碱性缓冲液，当在微通道两端施加电压时，两性电解质会形成pH梯度，待测组分在电场作用下迁移到pH与其等电点相同的区域时便不再带电，停止迁移，因此分离聚焦成一个个按照等电点次序排列的区带，在高效、快速聚焦富集的同时实现分离[44]。
胶束电动色谱(MEKC)作为一种特殊的电泳模式，样品各组分的分离是由样品淌度以及样品与胶束固定相的相互作用来共同作用，是一种基于可迁移非固态分离介质的电迁移分离技术。与区带电泳分离的不同之处在于，MEKC需要向缓冲溶液中加入表面活性剂，当其浓度大于临界胶束浓度时，通常由50～100个表面活性剂分子的疏水基团聚集到一起，亲水端向外，形成胶束(或称囊泡)。MEKC具有两个特点：没有静止的固定相；胶束作为准固定相在分离通道中会迁移。MEKC是色谱与电泳机理相结合的分离模式。胶束与电解质溶液有不同的迁移性质，中性物质的分离是基于分离物在胶束和溶液中的分配系数不同而获得的，而对于带电物质，分离机理则基于被分离物在两相中的分配系数不同，以及它们在电场中的电迁移的差异[45]。
介电电泳描述的是在非均匀交流电场中，悬浮在一定介质中的介电粒子因诱导极化作用而产生的定向迁移现象。其主要原理：不同电极结构产生不同的非均匀电场，介电粒子受正介电电泳力作用向高电场(或受负介电电泳力作用向低电场)运动，最终在不同的位置被捕获固定，因此可进行释放或移动粒子等操作，只需改变施加电压的大小、频率等条件，被分离细胞、细胞器以及细菌等颗粒即可根据所受到的介电电泳力进行移动，从而实现粒子的有效操控[46]。介电电泳技术具有方法简单灵活、捕获效率高、对细胞损伤小、可实时观察等优点。使用特殊的缓冲液，合理地设计电极结构及分析细胞所受到的介电电泳力，对保证被分离(或被操纵)颗粒的生物活性和实现高效操纵至关重要。
微流控芯片自由流电泳(free-flow electrophoresis)是一种独特的半制备型分离技术。其工作原理：当样品连续进入芯片分离腔室时，若在分离腔室两侧施加垂直于流体流动方向的电场，则样品中具有不同电泳迁移率的粒子在电场的作用下会在分离腔室中产生不同的偏转角，形成若干条互不干扰的样品条带，从而实现样品的分离与制备。样品粒子所产生的偏转角大小主要取决于电场力和流体阻力，而电场力正比于电场强度和样品粒子的电泳迁移率，流体阻力与分离腔室中溶液的线速度和电渗流有关。自由流电泳可以实现连续分离和制备，具有分离条件温和、样品用量少等特点，在多肽、蛋白、核酸、细胞等生物领域分离中发挥着重要作用，在空间生物科学研究中也得到应用[47]。但是，应用较广的同时，在封闭性微型化自由流电泳芯片中的诸多技术问题，亟待解决，包括：水被电解产生的气泡难以逃逸，破坏了流体的稳定性；氢离子和氢氧根离子的产生引起芯片分离腔室形成pH梯度；造成样品粒子的结构和电性等发生改变；产生焦耳热；影响分离性能；等等。
对于成分复杂的样品，仅用一种分离模式往往难以达到令人满意的效果，如果利用微流控芯片的整合优势，将几种基于不同分离原理的分离模式串联起来组成一个多维分离系统，则可增加峰容量，进而在分离复杂样品中发挥作用。与传统毛细管电泳系统以及色谱相比，在芯片上进行二维分离，可以通过设计芯片通道结构来实现通道的直接交叉或连通，而无须制作复杂的二维毛细管电泳接口，不仅更为简便，而且可避免因在接口处存在死体积而导致的谱带扩展现象。本课题组开展了多项二维芯片电泳的研究工作，包括：
(1)构建了固定化pH梯度等电聚焦与区带电泳耦联的二维芯片电泳方法[48]。
(2)利用等电聚焦与区带电泳耦联的二维芯片方法建立预测α-synclein蛋白聚集情况的新方法，并将其成功应用于细胞破碎液和组织匀浆样品的解析[49]。
(3)将等电聚焦与区带电泳耦联的二维芯片方法与基于石墨烯/适配体的荧光共振能量转移技术结合，构建结合分离的新型光学传感检测技术，实现了血液样品中多个蛋白的同时检测[50]。
(4)将等电聚焦与区带电泳耦联的二维芯片方法应用于靶向G-四链体的多个中药单体的同时筛选[51](图2.4、图2.5)。
图2.4 检测装置及微流控芯片通道结构示意[51]
(5)将等电聚焦与等速电泳以及多通道并行凝胶电泳耦联构建三维高效芯片电泳分离技术，并借助图像分析技术解析微生物全蛋白高分辨电泳分离指纹图谱，实现了混合菌样品中目标菌的定性和定量分析[52]等。
在芯片微分离技术的研究中，电驱动占大多数，因为它具有接口简单、接口密封和死体积小等优势。使用压力控制区带在复杂管路中的转移相对困难，而电驱动可以很方便地实现区带的转移和输运，在减少芯片外围设备的数量和体积情况下实现快速分离。同时，电泳的模式多，并且易于多种分离模式耦联。但是，其需要较高的分离电压，且单一模式分离能力低。
2.3.5.2 微流控芯片电色谱分离技术
色谱分离是指混合物的不同组分在固定相和流动相中由于分配性质的差异，引起迁移速度不同而得以分离。与电泳相比，电色谱具有更好的稳定性和重现性，其不受样品带电性质影响，是常规分析中应用最广泛的分离技术。微流控芯片电色谱分离技术可以克服传统器件的缺点，具有试样消耗少、分析速度快、分离效率高等优点，并且易于实现色谱系统的集成微型化和自动化。
图2.5 基于微流控芯片电泳分离传感的多种中药单体同时筛选示意[51](书后附彩插)
微流控芯片电色谱技术是指通过在石英毛细管内填充或内壁涂布，键合或交联固定相，用电渗流或结合压力来驱动流动相。其具有色谱和电泳的双重机理，依据溶质在流动相和固定相中分配系数的不同和自身电泳淌度差异来得到分离。电色谱克服了电泳难以分离中性物质的缺点，具有液相色谱固定相和流动相多选择性以及电泳塞式流的优点，具有高效液相色谱和毛细管电泳的优势[41]。
固定相在电色谱分离中起着至关重要的作用，目前有多种固定相材料被引入微流控芯片，包括：
(1)芯片通道内壁化学键合固定相的开管色谱柱方法。
(2)填充柱技术：在通道内填充色谱树脂颗粒填料。
(3)整体柱技术：通过加热或光诱导引发柱内单体溶液发生原位聚合反应，形成连续、整体、多孔固定相。
(4)膜材料。
(5)利用微加工色谱分离微结构，如明渠系统或者柱状微结构通道。
(6)纳米线。
填充颗粒状色谱填料包括天然多糖(琼脂糖、纤维素)、聚合物树脂(聚丙烯酰胺、三丙烯酸酯、甲基丙烯酸盐)和刚性无机材料(二氧化硅、氧化铝)，可以使用多种化学物质进一步修饰提高分离能力或者用于填料床在微流控芯片内部的固定。色谱颗粒填料具有高比表面积和高吸附容量，但填料的装填过程比较烦琐，需要加工柱塞、有截留功能围堰等结构，或借助磁场将填料限制在某个区域，以及将Sol-Gel作为“粒间胶”以达到均匀性填料，保持树脂完好无损，减少填料床压缩。小颗粒色谱填料在显著改善分离度和检测灵敏度的同时，对系统高压输送系统也提出了更高的要求。压力增加和低传质限制了其在分析中的应用，目前在芯片电色谱分离技术中，系统泵阀的加工和集成是技术的瓶颈，特别是耐高压微型泵阀的加工有待更多发展[53]。
寻找替代色谱材料颗粒填料的过程推动了整体柱技术的产生和发展。整体柱可以定义为“连续整体多孔固定相”，其不仅弥补了开管色谱柱相比比较低的不足，还由于孔隙连通性高，因此柱压小、渗透性好、压降小，可以实现快速分离。由于有多种单体和柱床修饰技术可供选择，因此整体柱固定相的种类丰富，应用范围广。根据起始材料和制备方法的不同，整体柱技术可以分为“无机”和“有机”两类。除了可以快速分离外，整体柱技术还具有制备简单的特点，仅需将预聚合溶液引入微流控芯片后进行原位聚合，无须柱塞。此外，还可以借助光引发反应在指定芯片区域进行聚合。
借助于微加工技术可以制造不同长度和内径的微通道，以及将规整的纳米微柱等微结构作为固定相载体。1998年，Regnier研究组首次采用深度反应离子刻蚀技术在石英芯片上加工了单元结构为5 μm×5 μm×10 μm的微柱阵列，并在微柱表面涂覆了聚苯乙烯磺酸，制得了反相电色谱柱，4.5 cm长度的色谱柱分离罗丹明123的柱效为35 000个塔板。微结构的加工技术首先是基于第一代玻璃或者硅基材质芯片的光刻、化学刻蚀以及金属沉积等方法，但由于硅基材料存在一些局限性，玻璃材料很难获得垂直内壁的通道，因此对低成本聚合物和弹性材料的需求推动了软平板印刷、热压、注塑、激光微加工和X射线光刻等加工技术的发展。光刻等刻蚀技术可制作微米-纳米尺度的微结构，但是在创建精确的亚纳米范围内的纳米结构方面受到技术限制。
2.3.5.3 微流控芯片颗粒物分离
微流控芯片细胞、细胞器和外泌体等颗粒物的分离方法可以从主动和被动的角度进行分类。被动方法包括基于抗体等的表面结合捕捉细胞和病原体技术、基于多孔膜的筛分技术、基于筛分结构的捕集技术；主动方法包括基于光学可极化特性的光镊方法、超声共振分离手段、介电电泳、电泳、流式分选以及磁分选。如果从分离机制的角度，也可以将目前微流控芯片中颗粒物分离方法分为物理和生物两大类，如表2.3所示。物理分离的机制主要是根据EVs的物理特性(如大小、变形性和流体力学特性等)的差异，通过在芯片中设置包括微孔、微过滤网和微柱等微结构单元，以及利用惯性力和侧向位移方法、声纳米滤波系统、电动浓缩EVs技术和浓差极化电泳来实现分离。物理技术提供了无须标记(或衍生化)、仅凭芯片自身结构或其他物理手段来实现颗粒物分离的手段。第二大类方法是利用被分离颗粒物表面的生物和化学特性差异来开展分离，主要基于抗原/抗体、受体/配体等生物特异性识别。将抗体、适配体固定于微通道内的纳米磁珠表面，或者将上述生物活性物质固定在芯片通道内的微纳结构、微纳图案表面，利用纳米材料或者纳米结构的高比表面积来增大生物亲和组分与外泌体表面蛋白的接触面积和接触机会[54]。
表2.3 根据筛分机理分类
除了不断引入新的技术手段，也有报道组合使用已有的技术，减少对某一技术的依赖，克服单一技术的缺点，不断提升分离捕获效率。以微流控芯片捕获循环肿瘤细胞为例，首先根据尺寸大小差异富集红细胞，然后采用惰性聚焦以及磁泳动的方法捕获未标记循环肿瘤细胞[55]。