2.3.8 微流控芯片检测技术
微流控芯片检测装置用于测定目标组分的组成或含量，包括灵敏度、检出限、检测速度和适用范围等指标。对有关检测器和检测方法的研究是微流控芯片系统研究中的一个重要部分。理想的微流控芯片检测的技术特征包括更高的灵敏度和信噪比：
(1)在微流控芯片分析过程中，由于可供检测物质的进样体积微小(微升、纳升甚至皮升级)，且检测的区域一般非常小，所以要求检测器具有更高的检测灵敏度和信噪比。
(2)更快的反应速度：通道短，同时满足整体便捷和快捷的需要。
(3)特殊的结构：要考虑总体分析系统的微型化，结构、体积和质量方面应利于集成化或者至少有利于同芯片系统的耦合，以及更有利于实现多重平行检测功能。
根据在微流控芯片分析研究中的不同检测原理，微流控芯片检测法可以分为光学检测法(荧光、紫外、化学发光、折射率)、电化学检测法(安培检测器、电导检测器、电位检测器)，以及与质谱检测或核磁共振联用的检测方法等。其中，光学检测法是微流控系统最常见的检测方式之一。这是因为，一般光学系统与微流控系统是非接触式的耦合，不存在被待测物污染与损失的可能；其次，较之其他检测方式，可以借助成型的光学检测仪器和成熟的光学检测技术。
2.3.8.1 光学检测
用于微流控芯片上的光学检测方法依原理可分为吸光度检测、荧光检测、化学发光和生物发光检测、拉曼光谱检测、折射率检测、热透镜光谱检测和表面等离子激元共振检测等。
吸光度检测是基于物质对光的选择性吸收而建立起来的一类分析方法，包括比色法、可见光及紫外吸光光度法和红外光谱法。常规吸光光度的仪器结构简单，虽然较之荧光检测的高灵敏度仍然存在差距，但可以测试一些不具有荧光性质的物质，无须进行荧光衍生化标记，是一种通用型的检测方法。但其受微流控系统中微通道的尺寸限制，吸收光程短，影响灵敏度，许多研究者采用比如改进通道设计的方式等方式来增加吸收光程或减少光损失，以提高系统灵敏度。另外，比色法是通过比较或测量有色物质颜色深度来确定待测组分含量的一种方法，通常通过目视将待测溶液与标准溶液比对定量。由于容易受到主观、分辨率等因素限制，所以目视比色法逐渐被分光光度法所取代。近年来，随着照相技术以及软件功能的发展，借助内置于智能手机中的摄像头以及扫描仪等拍照捕获图像装置的图像数字比色分析的方法受到关注。
荧光检测是利用荧光化合物在一定激发波长下可以释放特定的荧光，而其他物质对特定荧光物质的信号交叉干扰很小，故而利用荧光光谱可以灵敏地检测荧光物质。荧光检测灵敏度高且易与微流控芯片结合，从而使其成为微流控技术最主要的光学检测手段[60]。荧光检测的检出限低、选择性好，但是检测对象需要具有荧光效应或在荧光衍生后进行检测。
化学发光是物质在进行化学反应过程中伴随的一种光辐射现象，化学发光检测法是通过检测发光强度来确定待测物含量的一种痕量分析方法。化学发光检测法是公认的高灵敏度检测方法之一，并且选择性高、线性反应范围宽，有利于对分析物的定量分析。相比于荧光检测，其不受激发光源散射光的影响，也不存在荧光团漂白的现象，不受生物样品自带荧光的影响，是微流控系统理想的检测方法之一。但是，目前可以应用的化学发光体系种类有限，使用条件具有局限性，有待不断发展。由于检测不需要外来光源，因而减少了干扰，也简化了设备对光源的要求，只需要一个光电倍增管和光电二极管作为检测器，从而为微流控芯片检测系统提供了简单而相对价廉的设备，符合微流控系统微型化和集成化的要求。由于化学发光检测系统是通过光电检测器来测量发光强度来定量被测组分含量的，化学发光强度一般比较低，因此检测灵敏度的高低直接影响化学发光系统的性能，常采用高灵敏、稳定的检测器，如酶标仪和化学发光检测器，或者利用显微镜读取信号，但是这些外接设备导致的体积加大，与微流控芯片的微型化目标存在一定距离，也有研究者聚焦于研究集成化芯片检测器(如集成在硅片上的光电二极管和转换电极收集化学发光信号)，以提高集成化程度。
不同光学检测器的原理和特点各不相同，相应技术可以用于分析生物化学(蛋白质检测、细胞计数、酶动力学)、POCT、细胞生物学、免疫分析检测等。
2.3.8.2 电化学检测
电化学检测是通过将溶液中的待测物产生的化学信号转换为电信号，以实现对待测组分检测的一种方法。电化学检测的主要优势是灵敏度高、选择性好、体积小、装置简单、成本低廉，且因其优异的兼容性，适合微型化和集成化。微流控分析系统中采用的电化学检测器主要有安培检测器、电导检测器和电位检测器，由于采用电极作为传感器，因此整体系统结构可以更紧凑，体积更小。安培检测是电化学中的常用方法，其测量在一定电压下，电极发生氧化反应或还原反应后所产生的电流值，因此是对在电极上具有活性物质的检测，其检测灵敏度较高，但是选择性差，这在一定程度上制约了对其的应用。电导检测器根据带电组分对溶液电导率的贡献而进行检测，待测物无须电化学活性的基团，只要组分是离子型的都可以被检测到，所以电导检测器是一种较好的通用型检测器。电导检测器可以分为接触式和非接触式两种。接触式电导检测器与溶液直接接触，而非接触式则不然，非接触式避免了电极和溶液之间发生的化学反应而导致的电极污染和腐蚀，降低了对电极材料的要求和费用。电位检测器以其易于制作和便于小型化而受到关注。
2.3.8.3 质谱检测
荧光和电化学检测经常被用于已知(或特定)的一种(或几种)目标分子的检测，并且具有易于和芯片耦联的特点。但是面对复杂样品(如细胞裂解液或血液等含复杂成分的生物样品)，如何从复杂的干扰基质中快速甄别出目标分子，不仅要求具有高灵敏度，还要求兼具高选择性、高通量和高分辨率。质谱可以根据质荷比差异来实现多种物质检测，检测范围覆盖大部分小分子、多肽、蛋白和核酸等，是一种非标记获取被检测对象化学信息的强有力检测手段。微流控芯片与质谱联用技术为复杂样品前处理以及进一步解析提供了一个很好的一体化平台，可以用于细胞分析、疾病诊断、药物筛选和芯片器官的构建[61]。
电喷雾质谱(ESI-MS)更容易与芯片耦联，可用于分析检测蛋白、多肽、细胞裂解物和其他成分。芯片与电喷雾质谱耦联的关键是接口设计，需要尽量小的死体积、喷雾状态稳定，并且离子化效率高。常用的芯片电喷雾接口设计大体可以分为芯片尖端直接喷雾型、外接喷雾针喷雾型和外接毛细管喷雾型。这些离子源接口均没有脱离常规离子源或纳喷离子源的基本原理和特性，属于连续液流的分析，常需要辅助雾化和液流。另外，由于样品中复杂基质和盐分的存在会干扰和抑制样品的电离，需要采用比如集成固相萃取或液液萃取等芯片上样品前处理单元对样品进行脱盐等预处理以及预富集，或者采用芯片与色谱/质谱，芯片电泳/质谱耦联，简化样品构成，最大限度减少对电离的影响，实现高灵敏检测[61]。
基质辅助激光解析电离质谱(MALDI-MS)样品离子化是通过激光直接照射到样品分子与导电基质共结晶层，可以耐受较高浓度的盐等非挥发性成分，所需样品量低，同时灵敏度高，具有ESI-MS不可替代的优点，是进行生物大分子(如多肽、蛋白和核苷酸等)解析的理想手段。目前，MALDI-MS质谱与芯片联用通常采用离线方式，检测时，样品通过滴加、喷洒和点样等方式转移到基质芯片上。与将样品从芯片转移到MALDI-MS上进行检测比较，如果能够将MALDI-MS与芯片耦联实现芯片上原位检测会更受欢迎，此时芯片上的样品质谱检测区域为开放式。由于干扰分子(特别是盐分)仍然会削弱目标组分信号，并且产生杂峰增加谱图的复杂性，因此采用液相色谱、固相萃取、C18微量层析柱以及表面功能化纳米材料等方法在进行MALDI-MS检测前进行样品预处理可以进一步提高检测灵敏度。
微流控芯片的细胞培养部分在向变大(如组织和器官芯片)和变小(单细胞芯片)方向变化，前者能提供强大的模拟药物代谢和器官间相互作用的模式，而后者可为疾病诊断和基因分析提供更精细的信息。目前，芯片与质谱耦联在单细胞液滴、微流控探针、微阵列检测和亚细胞取样等方向都有新的进展。
2.3.8.4 表面等离子检测
随着科技的发展，电子器件已经做到纳米量级，而传统的光学器件由于受到光束衍射极限的限制仍处于微米级，这是与微流控芯片整合实现小型化和集成化的瓶颈。在传统光学器件中，当光通过曲率较大的弯曲波导时，会发生大量能量散射，光子器件难以进一步集成，随着纳米加工工艺水平的提高，光波导器件的尺寸也在向纳米级发展[62]。基于表面等离子体共振(Surface Plasmon Resonance，SPR)效应的波导元器件是实现纳米光子器件的重要研究方向。SPR检测器最基本的结构组成为棱镜、金属膜、样品，当一束光在一定角度范围入射到达棱镜的端面时，在棱镜与金属膜的交界面产生表面等离子体波，当入射光与表面等离子体波的传播常数相等时会引起SPR效应，此时入射光的一部分能量被吸收，形成共振峰，在其他参数(入射角度、金属膜和棱镜折射率、金属膜厚度)确定的情况下，反射率只与样品的折射率有关，因此样品折射率的变化会引起共振峰位置的改变，从而实现样品的检测功能。然而，表面等离子体激元是光子与金属表面的自由电子相互作用形成的电子疏密波，是一种二维束缚波，沿着金属-介质界面传输。在这种相互作用中，自由电子与其共振频率相同的光波在金属与介质界面发生相干共振，场强在金属与介质的界面上具有最大值，沿垂直与界面的方向在金属和介质中呈指数衰减。
SPR检测器的主要原理是器件的输出对待测物质敏感，待检测量的变化会影响SPP模式的模场、相位、偏振等特性，造成表面等离子体共振峰或输出功率的变化，从而分析待测物质的特性[62]。SPR检测器具有成本低、灵敏度高、可在线监测、检测效率高等优点，是应用最广泛的非标记光学检测手段。然而，传统的表面等离子体共振(SPR)仪器中的复杂的棱镜耦合阻碍了与微流控芯片的集成。纳米等离子体纳米结构(如纳米颗粒、纳米小孔)生物传感器可以克服上述问题，从而引起了关注。与金属薄膜表面的SPR传感不同，发生在纳米颗粒(如金、银)或纳米结构(纳米三角、纳米岛)局部的共振表现出独特的光学特性，入射光子频率与金属纳米粒子或纳米结构中传导电子的振动频率匹配时，在紫外-可见光区域表现出强吸收作用的光学响应，纳米颗粒所产生的感应电荷不能像波一样沿颗粒表面传播，而是被限制在颗粒表面，成为局域表面等离子体共振(LSPR)，此时在其表面几纳米范围内产生很强的局域电场，这一近场效应能增强其表面分子横截面的拉曼散射，可提供丰富的信息谱。SPR和LSPR已被引入微流控器件进行生物检测[63]。
随着微纳加工工艺的进步，采用电子束和离子束进行光刻以及使用扫描电子显微镜和原子力显微镜进行表征推动了等离子体纳米结构的发展和新的等离子现象的发现，人们研究的热情越来越高，提出了多种表面等离子体光波导结构，制作了多种光学器件，如定向耦合器、Mach-Zehndert调制器、干涉仪和分束器等[62]。除了纳米等离子体光子学，其他新的等离子体共振技术(如SPR成像(SPRi))、基于偏振和干涉的传感器也被用于构建微流控芯片SPR检测器，包括微流控芯片高通量检测器[64]。
2.3.8.5 光波导检测
光波导作为一种可直接进行光信号传输的介质，具有灵敏度高、尺寸小和成本低的优点，也是光学生物传感检测的一个热点。光波导生物传感器的发展方向主要分为平面光波导生物传感器、光纤生物传感器。平面光波导生物传感器的传感原理：一束光线以一定角度入射进入光波导，在波导内进行传输，当光线在导波层与样品层交界处发生全反射，产生的倏逝波透过生物分子相互作用层时，产生的光信号可使得光波导内传输的光信号的强度和相位发生变化，通过测量这些光信号特性的变化可以获取生物层上分子的相互作用信息。平面光波导生物传感器具有结构简单、体积小的优点，在生物传感检测中得到较广应用。然而，其灵敏度偏低，虽然可以通过对传感器的相关参数(如波导高度、狭宽度和个数等)进行调节来提升，但改进有限。
光纤具有质量轻、体积小、耐腐蚀、抗电磁干扰和性能稳定等优点，在生物传感领域应用广泛。光纤生物传感也基于倏逝波原理，光线在纤芯内传播，在纤芯与包层的交界面发生全反射，此时产生倏逝波穿透交界面到达包层，并以指数形式衰减，形成倏逝场，通过在包层设置样品点，样品点的信息变化(折射率、厚度等)会引起倏逝波的变化，反馈回的光信息利用相应的探测仪器接收，对相应的光信号进行处理分析，即可获得反馈的样品生物化学分子信息的变化。目前光纤生物检测器的研究方向主要是利用物理(或化学)方法使光纤发生形变(如直形结构、锥形结构、U形结构)，不受光强波动影响，同时易于光集成的光纤光栅传感器，以及D形光纤光栅、微纳光纤布拉格光栅以及光子晶体光栅等新型光纤生物传感器。
2.3.8.6 表面增强拉曼散射检测
开发具有无标记、无损、高灵敏度的微流控芯片，对于实现快速检测具有重要意义。拉曼光谱能提供由许多窄带峰组成的独特分子指纹，这些峰对应于分子的每个官能团中的亚分子振动模式，即使在多种分析物的混合物中也能识别分子种类。表面增强拉曼散射(SERS)技术利用贵金属纳米结构，能够通过局域表面等离子体共振(LSPR)现象来强化电磁场，从而使拉曼信号放大。将SERS检测技术引入微流控芯片分析系统具有独特的优势：SERS检测是一项无须标记的技术，可以对各种分子进行直接检测，并且对分析物没有损伤；SERS检测借助于化学增强和金属表面的局域电场增强，能实现低浓度分析物的高灵敏检测；SERS检测能实现对微流控芯片微米级的局域位置进行分析，对于芯片内的定点监控和细胞培养代谢物的实时定点分析或实现高通量并行检测，能发挥重要作用[65]。
2.3.8.7 微环谐振器检测
周围环境物质的折射率是十分关键的传感监测参量，可以直接或间接地反映周围环境物质的性质和状态。微环谐振器(MRR)检测属于折射率传感检测，根据折射率变化来检测周围物质的变化。对于硅基微环谐振器来说，当光在其中传播时，在微环波导芯外有倏逝场，倏逝场能够感应波导外界物质的折射率变化，该变化可被转化为可测量的光学特征参数，即通过检测谐振波长偏移量或特定波长处的强度变化量均可实现传感检测功能[66]。无标签MRR传感器可检测体系整体折射率的变化，在表面处理后还可以检测特定的生物(或化学)物质，因其体积小、灵敏度高、易于整合，尤其在高通量传感领域引起关注[23]。
2.3.8.8 对非连续流微液滴的检测
基于荧光的检测方法几乎被排除在对分段流微液滴检测中，而高检测灵敏度和选择性的时间积分发射光谱仪则更适合以高移动速度和千赫兹频率探测皮升体积液滴中的产物。通过荧光寿命图像，我们能以1 ms的时间分辨率来观测皮升体积液滴中的混合情况。采用无标记方法进行检测已成为最近的研究热点，比如采用表面增强拉曼光谱和表面增强共振拉曼光谱可以快速和灵敏地检测液滴内容物，获得亚毫秒的分辨率。此外，焦平面陈列检测器的发展促进了傅里叶变换红外光谱成像、光热光谱检测技术，这些都是光学检测的最新进展。电化学检测器以其小型化、灵敏和快速反应的特点成为富有吸引力的光学液滴检测替代技术，比如可以采用离子选择性电极检测RNA与镁离子结合的快速动力学，采用时间电流法来研究电催化反应。耦联质谱分析检测从芯片转移的液滴，可大幅提高能获取的信息量；多项研究聚焦于液滴微流控芯片与MALDI-MS谱或者电喷雾质谱耦联，实现对蛋白和酶的飞摩尔级别高通量检测。此外，液滴微流控芯片与核磁共振谱耦联对提取分子结构和动力学信息更有效，虽然检测灵敏度相对不高，但液滴微流控芯片通过与核磁共振谱的耦联可以获得更多结构和动力学信息。近年来，也有不少有关高分辨NMR技术的研究报道，显示该方法有望实现对单液滴的信息提取。
进行大规模实验时，在庞大液滴群中识别和检测特定液滴是一项特别的挑战。对于相对较小的规模，可以通过将液滴顺序导入扩展通道或沿着流动路径使用阱结构来捕获液滴。然而，面对数千个液滴，虽然使用小分子荧光物质可以实现在任意时间点对几千个液滴编码，但会受到凝聚相中光谱串扰的限制。不过，通过在每个液滴中引入唯一的DNA编码，可产生4n个编码容量，从而获得更大的编码能力[67]。
2.3.8.9 检测技术的新进展
几种主要微流控芯片检测方法的优缺点如表2.6所示。微流控上细胞研究中光学检测技术的发展使得细胞及生物分子的检测进入微米级、纳米级及更小级别的检测，试剂的低耗费、痕量试样检测和高精度分析使得微流控高通量检测更加成熟，为生物微纳系统的发展起着重要的促进作用。但现有检测方法对活细胞不同生命周期无创、实时、多成分的动态信息检测和传感仍有很大挑战，新的检测思路和方法仍需发展，同时芯片上细胞检测及传感应当越简单实用越好，最好通过图像及颜色信息就可以分析，如仅采用CCD[68]或微流控光学微镜(OFM)就可以完成信号采集，这有利于对细胞的无损检测及系统的小型化和便携化，也更便于现场实时检测。微流控芯片上微阵列、新敏感材料(如卟啉、特异探针和形状记忆聚合物等)的应用将为微流控系统上细胞检测提供有益的思路和借鉴。另外，小型化设备及微电子系统(如小型二极管激光器、LED、光纤及ARM嵌入式系统)的应用将使检测系统的成本更低廉，更便于使用[60]。
表2.6 几种主要微流控芯片检测方法的优缺点
基于单一分析物分析只能提供有限的信息，多个单一样品的并行检测或多目标的同时检测能显著提高检测通量，从而提高检测效率，更有利实现微型化和便携化。基于电化学和光学的多目标检测成为研究热点。目前，利用已有的电学和光学检测手段实现多目标检测主要有两种策略：
(1)采用并行多通道、微池阵列或电泳分离等空间隔离的方法，避免并行检测时的相互干扰。
(2)在光学检测时，可使用多色标记物区分不同的检测对象[69，70]。
微流控芯片的光学检测方法多样，而且一个芯片上可以集成多种检测辅助手段，利用微流控芯片对细胞的操纵(如流体切应力作用、液滴化处理)，再结合使用光学镊子、纳米技术、表面处理等，往往可以使检测更加灵敏和简便。此外，多种检测技术的结合应用可以扩展检测的信号范围和精度[71]，显示了微流控芯片检测方法的多样化和集成化。还有一种发展趋势是更加小型化、便携化，通过将光源、激发器、分析组件等检测元件小型化来减小检测的损耗和体积，构建简易的现场、实时检测分析系统，向着芯片实验室的方向不断发展。