实验方法的选择及评价
刑事科学技术检验的方法学评价和选择是刑事科学技术检验鉴定质量控制的重要基础工作。根据刑事科学技术检验鉴定的需要，在实验室要开展新的检验项目，或者对原来的方法进行更新，实验室应该根据项目的特点并结合本实验室实际条件，选择可以满足一定准确度和较好重复性的分析方法。不同的分析目的，对方法性能的要求不同，按照一定的程序进行方法学选择，同时对参考物的级别要求也不同。
一、实验方法选择原则
正确选择实验方法是保证检验工作质量的前提之一。刑事科学技术实验室应使用适合的方法和程序进行检验鉴定，包括被检验物品的抽样、处理、运输、存储和准备。在适当的时候，还应当包括测量不确定度的评定和分析检验数据的统计技术。
实验室应采用能够满足检验鉴定的需要、符合实验室有能力开展检验工作各项条件的检验方法，包括抽样的方法。一般情况下，实验室应按下列顺序优先选择检测方法：①法律法规规定的标准；②国际标准、国家（或区域性）标准；③行业标准、地方标准、标准化主管部门备案的企业标准；④非标准方法、允许偏离的标准方法。
上述检验方法中标准方法包括：①国际标准，如国际标准化组织（International Standard Organized，ISO）、世界卫生组织（World Health Organization，WHO）等；②国家（或区域性）标准，如中国国家标准（Guo Biao，GB）、欧洲标准（European Norm，EN）、美国国家标准学会（American National Standards Institute，ANSI）、英国标准（British Standard，BS）、德国标准化学会（Deutsches Institut für Normung e.V，DIN）、日本工业标准（Japanese Industrial Standards，JIS）等；③行业标准、地方标准、标准化主管部门备案的企业标准。非标准方法包括：①技术组织发布的方法；②科学书籍或期刊公布的方法；③仪器生产厂家提供的指导方法；④实验室自行制定的内部方法。允许偏离的标准方法包括：①超出标准规定范围使用的标准方法；②经过扩充或更改的标准方法。
实验室应确保使用的标准方法为最新有效版本，除非该版本不适宜或不可能使用。当有几种方法可供选择，或标准化方法中提供多种可选程序时，实验室应制定相应的选择规定。为防止由于检验随意性给检验结果造成的危害，必要时实验室制定附加细则作业指导书对标准加以补充，以确保应用的一致性。
检验细则的制定应着重考虑样品对检验活动程序的要求：①检测样品的安全性、代表性、样品检测中可能存在的不可重复测量性；②样品各个检测指标的相关性；③环境对测量结果的影响；④测量仪器设备的调配限制；⑤数据采集、分析与处理；⑥测量不确定度的评定；⑦检测中断的影响及其他因素。制定后的检测细则应由技术管理层批准。实验室所选用的方法应告知委托单位。
实验室应积极主动收集本行业、本部门的检验标准，收集到的检验标准应由技术管理层批准后，再由质量管理部门登记编号存档控制使用。同时，对在用的检验标准进行有效性的跟踪，做好检验标准的查新，安排有关人员一定周期重新查新确认一次，保证检验方法的有效性。如果新标准与旧标准相比，检测资源配置和技术要求有较大变化时，技术管理层应组织相关人员对新标准开展宣贯，必要时应对实验室执行新标准的能力重新进行验证。当上述情况发生时，质量管理部门应着手组织向资质认定管理机构提出扩项的申请。
实验室首次采用标准方法进行实际检验工作之前，应确保能够正确地运用这些标准方法。如果标准方法发生了变化，应重新进行验证。当需要采用非标准方法时，方法在使用前应经过适当的确认。当委托方要求变更检验方法，提出指定的方法时，实验室必须对该方法的有效性进行确认，以确定变更或偏离是可行的。如果指定方法已不适合或已过期时，应及时通知委托单位，提请委托单位另行选择其他有效的检验方法。如果委托方坚持采用原来提出方法时，应在签订鉴定合同时注明，并由委托人签字确认，同时报告实验室技术管理层作偏离授权。对于实验室认可或资质认定项目，检测和校准方法的偏离须有相关技术单位验证其可靠性或经有关主管部门核准后，由技术负责人批准和委托人接受，并将该方法偏离进行文件规定。
二、采（抽）样程序制定
正确采集样品是保证数据准确性的前提。由于采（抽）样工作是整个检验工作中的重要一环，鉴于样品来源的复杂性及所需检验分组的不同，应根据样品种类和检验项目，制定不同的采（抽）样程序。如果在相应的检验标准中已有采（抽）样规定的，执行检验标准；如果在相应的检验标准中没有规定的，实验室应制定采（抽）样程序。只要合理，应根据适当的统计方法制定采（抽）样程序。
实验室制定的采（抽）样程序，一般规定采用随机抽样方式，注意采集的样品具有代表性和均匀性，特殊样品（如应急样品等）的采集要具备典型性。某些情况下（如检材的量少），样品可能不具备代表性，而是由其可获得性所决定，实验室应在检测报告上明确声明，本检测结果仅对来样负责。
采（抽）样方法中，还应规定采（抽）样现场需要调查并记录的因素以及样品运输、储存及处理的条件。同时，还应规定不同样品采（抽）样时的注意事项，以保证采（抽）样品的合理性，如理化检验样品应有防化学性污染的相应措施。微生物检验样品采集必须无菌操作，避免杂菌污染。采集生物物证进行DNA检验时必须由掌握相关专业知识和操作技能的工作人员进行，同时需配备与采集生物物证样本所需要的设备与工具，在采集过程中应具备有效防止污染检材的措施和保证生物物证样本质量的技术方法和手段，并对样本的来源、采集过程和方法等作详细记录。样品需注明抽样编号、抽样时间、样品名称、来源、采样者、所有野外调查及采样情况、样品保持方法及采样时的气候条件等信息。当客户对采（抽）样方法的规定有偏离、添加或删改的要求时，还应详细记录这些要求和相关的采（抽）样资料，并记入包含检验结果的所有文件中，同时要求将这些偏离通知有关人员。
三、方法选择与评价的基本步骤
（一）提出要求
根据刑事科学技术检验鉴定工作的需要，包括鉴定人员为提高检验结果的准确度和灵敏度需要，实验室对改进方法性能的需要以及实验室的设备条件、人员业务素质、工作量等具体情况，提出某项检验分析及方法要求的设想。
（二）获取资料
在本实验室原有工作的基础上，查阅相关的实验方法方面的文献、回顾综合性文章、同行的交流其他实验室的研究结果或在专业性会议上获得的信息，还可以向相关试剂、仪器生产厂家获取技术资料，充分了解各种方法的特点、科学依据和真实的使用价值。
（三）选定候选方法
对获取的资料进行仔细研究，初步确定候选方法。对选定的方法应明确该法的原理、所用仪器、试剂来源和纯度、标本采集要求、详细的操作步骤、结果计算和分析、参考范围、注意事项等。考虑候选方法的特异性、准确度、精密度和线性范围以及试剂成本、培训时间和应用价值等，这些性能要通过预试验进行初步评价，并在临案应用前进行严格、系统地评价以验证其各项性能特征。考察候选方法的详细要素如下：
1.分析方法的原理、原始参考资料以及仪器试剂供应保障。
2.试剂和参考物质的成分、包装量；开瓶前、后的保存条件要求；稳定性（如保存期）等。
3.所产生的废弃物种类、可能的危害及处理办法，需要的安全防范措施。
4.标本要求、采样条件、样本量、抗凝剂、防腐剂和必要的保存条件等。
5.准确度、精密度、敏感性、特异性和参考范围等的初步评价。
6.建立试验方法的标准化操作规程。
7.试验所用的设备、设施等要求，以及方法的局限性。
（四）候选方法的初步评价
对候选方法的初步评价试验包括：
1.标准曲线的线性范围和重复性。
2.标准品和新鲜标本的重复试验，以初步考查其精密度。
3.分析不同浓度的标本，并与公认的参考方法做比较，以初步考查方法的准确度。
4.仪器和商品化试剂符合国家有关规定的证明。
通过对候选方法的初步评价使实验室工作者熟悉有关技术，掌握各个分析步骤要点，判以能否适合本室条件要求，确定是否有必要作进一步研究。
四、标准方法验证
在引入新的标准检验方法之前，实验室应证实能够正确地运用这些标准方法。在此仅以理化检验的方法为例说明标准方法的验证。刑事科学技术实验室对于首次采用的标准方法，在应用于样品检测前应对方法的技术要求进行验证。验证的参数包括：
（一）检出限和检测限
1.空白试验（Blank Test）。在不加样品或以等量溶剂替代样品液的情况下，按与测定样品相同的方法和步骤进行定量分析，把所得结果作为空白值，从样品的分析结果中扣除。空白值能全面反映检验工作中所用试剂（包括纯水）与分析仪器的质量状况，并反映分析人员的素质和技术水平以及实验室的环境条件等各方面的问题。在刑事科学技术检验鉴定中许多样品内所含的待测物极其微量，有些刚刚能区别于空白值，因此对空白值的控制就尤其重要。在实验室中，为得到稳定且尽可能低的空白值，通常采取以下措施：①保护纯水的质量不发生变化，通常采用电导、酸度和微量有机物的分析来说明纯水的质量；②对试剂及溶剂中的杂质进行严格的检查；③谨慎保存清洗后的器皿，以防污染。
重复分析时，空白试验结果之间的变异服从随机分布规律。合理的空白试验重复次数与样品分析的重复次数应一致，这样可以使随机误差合理地包含在总误差中。当有充分证据证明空白值相当稳定并在控制下，可以减少空白试验次数。
2.检出限（Limit of Detection，LOD）。是指对某一特定的分析方法，在给定的置信水平内，能定性检出待测物质的最小浓度或最小量。检出限可根据空白试验的多次测定计算得到，它反映测量系统的质量水平。
国际纯粹与应用化学联合会（International Union of Pure and Applied Chemistry，IUPAC）规定检出限L可由公式（3-1）和公式（3-2）计算。(https://www.daowen.com)
式中，xL为在一定置信水平内被测物能被检出的最小分析信号；
为多次空白测量的平均值；Sb为多次空白测量的标准偏差；k为根据一定置信水平确定的系数；S为测定方法的灵敏度，即校准曲线的斜率，实际意义为单位浓度或量的待测物质产生的分析信号值。在光谱分析中，通常取k=3。
在实际工作中，某些分析方法的检出限也有特殊的规定：气相色谱法以二倍噪声水平信号对应的浓度或质量作为检出限；离子选择性电极法则以校准曲线的直线部分外延的延长线与通过空白电位且平行于浓度轴的直线交点所对应的浓度为该方法的检出限。
3.检测限（Limit of Determination）。亦称定量限（Limit of Quantification，LOQ），是指对某一特定的分析方法，在给定的置信水平内，能定量检出待测物质的最小浓度或最小量。检测限反映了检验实验室和测试系统的本底和基础，同时也反映了检验实验室和分析人员的水平。检测限同样由公式（3-1）和公式（3-2）计算，此时k=10。
（二）线性范围
在刑事科学技术检验鉴定中，常用校准曲线法进行定量分析。校准曲线（Calibration Curve）是用于描述待测物质浓度（或含量）与测量信号值之间定量关系的曲线。校准曲线包括工作曲线（Working Curve）和标准曲线（Standard Curve）。配制一系列不同浓度的标准溶液，采用与样品分析完全相同的步骤进行测定，以测得的信号值对标准溶液中待测物质的浓度（或含量）绘图，所得曲线称为工作曲线。如果标准溶液的分析步骤与样品的分析步骤不完全相同，得到的校正曲线称为标准曲线。根据样品的测定值，依据校正曲线即可求出待测物质的浓度（或含量）。
校准曲线的绘制可以采用绘图法或用最小二乘法进行线性回归。绘图法绘制校准曲线易受分析人员的主观因素影响，误差较大。最小二乘法进行线性回归求出的回归方程y=bx+a，根据回归方程绘制的校准曲线不受分析人员主观影响。方程中y为测定信号值；x为待测物质的浓度或含量；a为曲线的截距，代表空白值；b为曲线的斜率，表示单位浓度或含量的待测物质产生的信号值大小，也称灵敏度（sensitivity）。b越大，表示测定方法的灵敏度越高。校准曲线的线性好坏常用测量信号值与待测物质浓度或含量的相关系数来反映。相关系数的绝对值越接近1，校准曲线的线性关系越好，说明各测定溶液的测量误差越小。对于筛选方法，相关系数的绝对值不应低于0.98；对于确证方法而言，相关系数的绝对值不应低于0.99。
校准曲线的线性范围是指待测物质浓度或含量与测定信号值呈线性关系的浓度或含量范围。待测物质的浓度或含量应在方法的线性范围内。线性范围越宽，表明样品测定越方便，多数样品不必稀释或浓缩即可直接测定。
（三）精密度（precision）
检验方法的精密度是指在一日内连续平行测定多份同一样品和在一段时间内多次重复测定多份同一样品所得结果之间的符合程度，常用多次测定结果的相对标准偏差（Relative Standard Deviation，RSD）表示。RSD越小，表明测定结果的随机误差越小，精密度越高。由于微量分析的误差随待测物质浓度或含量的递减而出现增加的趋势，在试验中常于检验方法的线性范围内选择高、中、低三种不同浓度或含量的标准样品各进行6次重复测定，分别计算各种浓度或含量的日内和日间相对标准偏差。一般要求测定方法的相对标准偏差≤10%。
（四）准确度
准确度是指样品的测定结果与已知值或真值的符合程度，是反映检验方法系统误差和随机误差大小的综合性指标，它决定检验方法的可靠性。评价检验方法的准确度的常用方法有：
1.使用参考标准或标准物质进行校准。
方法准确度评价时，将标准物质用评价方法进行若干次重复测定，然后对测量平均值与证书上的标准值进行比对。标准物质的标准值范围为A±U（A为标准值，U为不确定度），对标准物质的测定结果为
±tafS/
，如果|
-A|≤［（tafS/
）2+U2］
则表明标准物质的测定结果与标准值是一致的，表明分析方法与测定过程的准确度令人满意，相应条件下样品的分析结果准确可靠。
2.加标回收试验。
在没有有证标准物质的情况下，可以向样品中加入一定量的待测组分的纯物质，用待评价方法同时测定样品和加标样品，按公式（3-3）计算加标回收率。
计算所得加标回收率不得超过方法规定的回收率范围，如方法未做回收率规定的，则以95%～105%为目标范围计算95%置信区间，作为正常允许范围。
采用加标回收试验时应注意：①加入的纯物质形态应尽量与样品中待测物质的形态保持一致；②加标量应与样品含量接近，且总量应在检验方法的线性范围内，不得高于方法检测上限的90%；③加标后样品体积应无显著变化。
加标回收试验评价方法准确度存在一定的局限性：①由于样品中可能存在对测定结果产生恒定干扰的因素，在样品与加标样品同时测定时，称为等效干扰，从而无法从加标回收率试验反映出真实的偏差；②分析过程中对样品和加标样品的操作完全相同，以致操作、损失、环境污染等对二者产生相同的作用，使误差相互抵消，从而难以发现分析过程中的一些问题；③样品中待测组分与所加标准纯物质在形态上或形式上的差异、加标量的多少、样品中待测组分原浓度的大小等，都会影响加标回收的结果。因此，即使加标回收率为100%，也并不能肯定分析结果准确度就一定高。
虽然加标回收率反映分析结果的准确性有一定的局限性，但仍然是反映分析方法准确程度的常用方法之一。
3.与其他实验室进行比对。
不同的实验室用同一方法对同一样品进行测定（最好是在线性范围内取高、中、低三种不同的浓度），测定结果经显著性检验应无显著性差异。由于不同的实验室环境不同，分析人员的技术能力不同，仪器设备不同，所用试剂耗材不同，因此当不同实验室分析所得结果一致，则表明实验室具备运用相应检验方法开展某项特定检测的能力，其方法准确度也是令人满意的。
4.与其他方法所得的结果进行比较。
将待评价方法与其他方法（一般为公认的标准方法）进行对照试验，即用两种方法同时对同一样品进行测定（最好是在线性范围内取高、中、低三种不同的浓度），两种方法测定结果经显著性检验应无显著性差异。由于不同的方法对样品的反应不同，所用试剂、仪器也多不相同，因此当两种方法所得结果一致，则表明待评价方法的分析质量可靠，其方法准确度也是令人满意的。
实验室在对未加修改而使用的已确认的检验程序常规应用前应进行独立验证。方法的验证一般采用实验室间比对计划，当无实验室间比对计划可利用时，实验室应采取其他方案，尽可能使用适宜的物质（包括有证标准物质或标准样品、以前检验过的样品、与其他实验室的交换样品、实验室间比对计划中日常测试的质控物）进行验证。根据检验结果的预期用途，尽可能全面地获取检验程序的测量正确度、测量准确度、测量精密度、测量不确定度、分析特异性（含干扰物）、分析灵敏度、检出限和定量限、测量区间、检验特异性和检验灵敏度等相关的性能特征指标，作为客观证据证实检验程序方法的性能与其声明相符。同时，实验室应将验证程序文件化，并记录验证结果。验证结果应由适当的授权人员审核并记录审核过程。
五、实验室内部方法的制定
由于刑事科学技术检验鉴定中所遇到的检材种类较多，为解决检验中的相关问题，必要时需要实验室自行设计和制定检验方法，同时需要采取必要措施保证此类方法能满足检验鉴定的需要，对从开始到结束的全过程进行有效控制，保证新制定的检验方法能顺利开展，确保开展新检验方法的工作质量。
（一）制订有关内部方法的规划
实验室自行制订检验方法的过程应是有计划的活动，应指定具有足够资源的有资格的人员参与计划各阶段的工作。检验方法设计开发计划应经过实验室技术负责人审核批准。制定的检验方法至少应该包含下列信息：①适当的标识和范围。②被检测或校准物品类型的描述。③被测定的参数或量和范围。④仪器和设备，包括技术性能要求。⑤所需的参考标准和标准物质（参考物质）。⑥要求的环境条件和所需的稳定周期。⑦检验程序的描述，包括检材的附加识别标志、处置、运输、存储和准备；工作开始前所进行的检查；检查设备工作是否正常，需要时，在每次使用之前对设备进行校准和调整；观察和结果的记录方法；需遵循的安全措施。⑧接受（或拒绝）的准则和（或）要求。⑨需记录的数据以及分析和表达的方法。⑩不确定度或评定不确定度的程序。
（二）检验方法的实验准备
工作人员应在查阅国内外有关文献的基础上，了解待测物的结构和物理化学性质和已有的检验方法的原理和优缺点，提出新的检验方法或改进原有的方法。实验准备包括：根据文件资料内容制定开展检验的实施细则，确定开展新检验方法所需的环境条件、仪器设备、实验材料等，并根据检验方法要求设计合适的格式化记录、报告、验证和总结的表格。
（三）检验条件的优化
1.样品前处理
通常对影响检验方法精密度、灵敏度、准确度和方法检出限或定量限的主要因素以及样品的前处理条件进行优化。尽量使检验条件相似的其他实验室也能开展该检验项目，保证有比较多的实验室能开展相关的验证和比对实验。
（1）无机成分前处理：如进行样品中无机成分检验时，选择采用无机化处理的方法（干灰化、湿消化法或微波消解法），并对所选用方法的条件进行优化。
（2）有机成分前处理：当进行样品中有机成分检验时，首先，根据待测物和样品的性质，选择合适的提取溶剂和提取方法。通常采用对待测物溶解度大的溶剂，可以采用一种或几种溶剂混合进行提取。提取的方法可以选择液-液萃取、机械振摇提取、超声波萃取、索氏提取器提取、加速溶剂萃取等方法。提取条件的选择，一般以待测物的提取效率作为评价指标。通常以加标样品或阳性样品用不同溶剂和不同提取方法进行提取，将测定结果同标准结果进行比较，计算提取效率，以提取效率最高的提取条件为最佳选择。其次，进行样品提取液的分离和净化，可采用的方法有色谱法、液-液萃取法、固相萃取法等，常选用装有不同吸附剂的固相萃取小柱，如C18、硅镁吸附剂等小柱。将样品提取液转移至经活化处理的固相萃取小柱上，用某种溶剂洗除杂质，再用适宜的溶剂将待测物质从小柱上洗脱下来，使待测物质与样品中的杂质分离，通常需对净化条件和洗脱条件进行优化，包括洗脱溶剂种类的选择以及洗脱溶剂用量的选择等。
2.试验设计
检验方法的优化通过试验设计来完成。试验设计（Experimental Design）是指在试验因素可取值的区域内，科学地安排试验，最有效地选择试验点，并通过试验数据确定指标的最优值。
（1）基本概念：①试验指标（Target of the Experiment）：用来衡量试验效果的物理量，简称指标。指标分为单一指标和多个指标，也可分为定性指标和定量指标。②因素（Factors）及水平：影响试验指标量值的物理量称为因素，也称因子。因素在试验中所处的水平状态称为因素水平（Levels of the Factor）。③同时试验：同时进行诸因素各水平的试验，从而得到最优化试验条件。④贯序试验：每进行一次或少数几次试验后，分析已取得的数据，再设计和进行后面的试验。
（2）常用的试验设计方法：检验条件的优化可以采用单因素条件试验，也可采用正交试验设计（Orthogonal Experiment Design）、析因试验设计（Factorial Experiment Design）、均匀试验设计（Uniform Experiment Design）、单纯形试验设计（Simplex Experiment Design）等多因素试验设计。最后一种属于贯序试验设计，在此仅简单介绍正交试验设计。正交试验设计是最常用的多因素、多水平的试验设计方法。它采用正交试验表安排试验，可用较少的试验次数获取各因素对试验指标的取值影响。例如，三因素三水平的方法试验，若采用单因素条件试验，每次只改变一个因素的水平，其他因素水平固定，逐个研究各因素对试验指标的影响，完成整个优化共需要进行27次试验，此时确定的条件还不一定是最佳条件。而采用正交试验设计，可以选用L9（34）正交表，仅需进行9次试验即可完成最优化条件的选择。由于正交试验表的搭配具有均匀分散和整齐可比性的特征，最后获得的优化条件比单因素条件试验确定的条件更佳。