第四节 基因治疗
第四节 基因治疗
一、基因与基因治疗的定义
1．基因 是染色体DNA序列，用于产生功能产物:多肽(polypeptides)或功能RNA分子。基因不仅包括实际的编码序列，而且包括使基因表达合适的相邻核苷酸的序列，即产生正常的mRNA分子的序列。基因的编码部分称之为外显子(exons)，它由非编码的间隔序列——内含子(introns)隔开，内含子在转录不久就被剪切并留在核中。成熟mRNA是其被转录的基因大小的1/10左右。由于总是一种基因的DNA链翻译成mRNA，因此每种基因只产生一种mRNA。转录是基因作用。科学家经常把基因称为生命的蓝图。基因使遗传品质代代相传。
2．基因组 生物的总的遗传物质，即生物的完整DNA序列称之为基因组(genome)。人类基因组极其复杂，含有约10万基因。DNA双螺旋的碱基对之间的距离为0．34nm，而在单倍体人类基因组中有约3×109碱基对，长度约1m。人类基因组组成分析是一令人产生浓厚兴趣的领域。作为人类基因组计划的一部分，科学家正从分子水平鉴定与了解基因的遗传信息。
3．基因治疗 一般是指将限定的遗传物质转入患者特定靶细胞，以最终达到预防或改变特殊疾病状态为目的的治疗方法。运载治疗性遗传物质的工具称之为载体(vector)。载体通常是病毒，但目前也用非病毒载体。基因疗法一般可分为以下两类:
(1)体细胞系基因转移 用于治疗遗传疾患;疾病预防，如疫苗接种。
(2)胚系基因转移预防遗传性疾患 临床上，基因治疗指体细胞基因治疗。这意味着靶细胞不属于胚系。目前胚系基因治疗由于伦理方面的原因不准用于临床，但将来有可能用于遗传病的治疗。基因治疗一般是引入修饰基因于患者体内而并非是该基因的细胞产物。术语“遗传工程”(genetic engineering)应用于活细胞的遗传操作，而移植遗传工程细胞进入活体可认为是基因治疗的一种形式。
二、基因治疗的历史发展
表7－1示基因治疗的历史发展及其在神经疾患方面应用的标志。但仅用一张表不可能浓缩所有的历史事件。分子生物学、医学遗传学和基因转移技术方面的新发现为神经性疾患基因治疗的发展奠定了基础。从表中列出的事件，我们可以形成一个时间概念，即在基础研究发现与动物实验及新技术在人类的应用之间的时间跨度是多少。虽然人们早在1952年就认识到病毒能传递基因，但是直到20年以后才建议使用病毒载体进行基因转移。逆转录病毒用于基因转移1981年已开始，而第一项经授权的人体基因治疗实验开始于1992年。
表7－1 基因治疗发展的历史标志
(续表)
(续表)
三、基因治疗的分类
表7－2 为各种基因治疗方法的简单分类。
表7－2 基因治疗的技术简要分类
四、基因治疗技术
基因治疗的各种技术见表7－2。通过将正常基因导入细胞或直接修复可以矫正突变的基因。另一种方法是经基因工程引入新的功能基因于细胞使之带有新的性质。这些技术大多是所谓的基因转移技术。基因治疗基本上涉及三步:基因导入(administration)、转移或传递(delivery)和表达(expression)。
1．基因导入 基因导入是指把基因或含有基因的载体导入机体。
2．传递 基因传递是指基因从导入部位进入靶细胞核。
3．表达 基因表达指细胞中治疗性基因产物的形成。
为此需要各种类型的载体，包括病毒性载体以及非病毒性载体。植入经遗传修饰的细胞也被认为是基因治疗的一种形式。另一种形式的基因治疗是通过反义技术抑制基因的异常表达，反义技术并不涉及任何基因转移。其他几种基因治疗的新方法也在研究之中。基因转移至患者可以是离体的(ex vivo)或体内的(in vivo)，分别构成回体基因治疗和体内基因治疗。
在进行基因治疗过程中，多聚酶链反应(PCR)是较重要的分子诊断技术。首先，PCR有助于诊断遗传病、病毒感染和癌症，这些都是基因治疗的候选疾病。PCR还应用于基因治疗的某些过程。PCR是以DNA片段的酶促扩增为基础，需要侧连两个“引物”，即与靶序列的相对链杂交的短寡核苷酸片段和由DNA多聚酶催化的互补DNA序列的合成。聚合酶链反应为重复数个循环的三步过程，包括变性、退火和延伸。三步循环重复进行，而每一阶段拷贝的数量加倍——从2到4到8等等。该反应由改变温度来控制:使用特殊的热稳定Taq多聚酶，第一步反应在94℃，第二步反应在55℃，而第三步反应是72℃。20循环之后就有约100万拷贝。有几种检测方法用于扩增的DNA。Southern免疫印迹可用于检测DNA。其他方法是利用酶DNA交联，如荧光和化学发光。
通过应用逆转录酶制备RNA的DNA拷贝也可研究RNA，该方法使科学家能研究细胞中合成特异蛋白的mRNA或检测RNA病毒的基因组。
基因克隆(gene cloning):在遗传工程中，基因克隆可将对应于特异蛋白质的基因连上克隆宿主(载体)以便能转入宿主细胞。载体可以是质粒(p1asmid)或噬菌体(bacteriophage)。质粒通过转化过程进入宿主细胞，这使得完整的DNA融入与穿过细胞膜。对于噬菌体，外源DNA以同样的方式插入病毒基因组。病毒DNA(携带插入片段)经病毒感染进入细胞，基因伴随病毒基因组表达。当携带噬菌体的细菌被杀灭时，重组的病毒基因组拷贝得以释放。如果将病毒的某些基因除去而产生一个能感染细胞但不进入裂解循环的载体，DNA就能在细胞内稳定表达。
基因治疗中克隆技术的作用:目前大多数有关克隆的讨论都是围绕制造完整的成年个体的遗传拷贝方面。这是由Dolly——一只从成年羊细胞克隆的羊羔的成功克隆所引发大多数国家都明令禁止有关克隆人的实验。产前诊断可检测胚胎是否受累，而父母有权选择流产或碰碰运气。利用克隆技术的基因疗法可纠正这种遗传缺陷。功能基因如CFTR也可通过载体插入胚胎细胞。伴随基因插入的标记序列可用于鉴定已正确载入该基因的细胞，而这些细胞之一的DNA可植入母亲的新生卵细胞，这一步可使胚胎换成一自身健康的克隆。克隆技术有益于体细胞基因治疗方面的基础研究。通过制备大量遗传上相同的细胞，克隆技术可帮助阐明胚胎细胞分化成为特殊细胞类型的过程。在这一过程中，所发生的可引起疾病的错误也可得以确定。克隆技术还有助于确定纠正各种疾病所需针对的靶基因。
五、基因治疗的创新方法
基因疗法本身就是一种创新并将继续发展的方法。各种基因治疗的新方法也在开发中，本书仅介绍其中的几种。这些疗法的重要目标是融合限制表达的机制于靶组织并对织织内基因表达进行精确调控。
1．靶向基因治疗 使基因转移至特殊的靶细胞是改善基因治疗效果及限制不良作用的重要方面。理想的基因治疗载体应该是静脉内传递并只转染特异细胞。目前的载体在体内仅按血流决定的方式转染细胞及导入部位。Harris和Lemoine(1996)综述了靶向基因治疗的各种战略(表7－3)。
表7－3 靶基因治疗策略
2．基因表达的受控诱导为了满足基因表达调控的需要，科学家在过去的10年里发展了几种可诱导基因表达系统。表7－4示各种调控基因表达的方法。
表7－4 基因治疗中调控基因表达的途径
3．胚系基因治疗 胚系基因治疗可定义为纠正患者胚细胞或生殖细胞的遗传缺陷以便其下一代的基因缺陷得以纠正。可以认为这可能是体细胞基因疗法的发展。DNA作为遗传物质的独特性质使之可导入胚系，并因此以可遗传的方式修饰基因组。这清楚地表明体细胞基因疗法向前迈出了一大步，并且可充分利用DNA的威力。
胚系基因治疗克服了体细胞基因治疗的局限性并能纠正遗传病患者的基因缺陷。在理想条件下，传递至躯体组织的DNA能使患者终身产生相应的蛋白质，但经修饰的组织将随患者死亡。因此，外源基因没有通过个体的胚系，患者的子代不会遗传原先的基因缺陷。有人辩论说，体细胞基因治疗使带缺陷基因的患者发育、生长及成熟，并且把缺陷基因遗传给子代。如果用个体胚系的功能拷贝取代缺陷基因，功能基因不会随个体死亡但可遗传给子代，因此解决了下一代的问题。
4．基因标记 基因标记研究的目的并不在于直接治疗疾病而是期望能够提供有关正常细胞生物学和疾病病理方面的信息。基因标记可用于跟踪体内几乎所有组织的行为。被标记的细胞不仅需要跟踪其一生而且需要跟踪其后代。这需要应用整合人宿主细胞DNA的载体。实际上，至今所做的标记物研究都使用逆转录病毒载体。造血细胞的基因标记没有立即给患者带来益处，但从这些研究中获得了信息。这些信息有助于改善治疗方案，研究结果提示医师采取自体造血干细胞(HSG)移植可消除肿瘤。
5．评价基因表达的方法 易于编码可分析的标记蛋白的基因有益于确定基因转移的效率和启动子活性。代谢β-半乳糖基因通常用于这一目的并构建携带该基因的逆转录病毒载体。传统检测半乳糖活性的方法包括经无色底物X-gal处理后固定组织，前者会转变为蓝色化合物。现已发展了其他一些方法如化学荧光检测细胞提取物中β-gal的活性。这些方法都不能进行活细胞检测与活细胞的进一步培养。荧光活化的细胞分类系统(FACS)即流式细胞仪已用于克服这一难题，但可导致大量细胞死亡。绿荧光蛋白(GFP)流行作为一种新的标记基因。GFP的表达易于通过荧光显微镜分析且无须固定。这样较低水平的表达易于分析而表达的细胞易于经FACS进行分类。GFP基因包涵体作为基因标记能评估细胞的含量使得回体基因治疗更为简便。
六、微创基因治疗的前景
以基因转移为基础的微创基因治疗要在临床上很好地应用，还有待理论和各种技术的进一步发展完善。过去20～30年基因治疗的发展已取得了巨大成就，已被看成是对先天和后天基因疾病的潜在有效的治疗方法，不过其依然存在缺少高效的传递系统、缺少持续稳定的表达和宿主产生免疫反应等问题。今后基因治疗研究将主要向两个方向发展:一是基础研究应更加深入，以解决在临床应用中遇到的一些困难及基因治疗本身需要解决的一些难点;二是临床试用项目增多，实施方案更加优化，判断标准更加客观，评价效果更加精确。
尽管基因治疗存在诸多问题有待解决，公众和学术界对其也褒贬不一，但我们相信，作为一种对人类健康影响宽广而深远的治疗方式，基因治疗——这个年轻的领域，正朝着治愈更大范围人类疾病迈进，为人类带来了希望，它在遗传性疾病、肿瘤等疾病的治疗上将具有深远的意义。
总之，随着分子生物学、分子遗传学以及临床医学的发展，基因治疗也会不断发展，日趋成熟，很多难题会得到解决，并在临床上得到广泛应用。