【实训操作方法】
一、紫外-可见分光光度法的基本原理
一般具有芳香环、共轭双键等结构的药物，均可在紫外区（190～400nm）或可见光区（400～760nm）产生吸收。可用紫外—可见分光光度法进行鉴别、检查及测定含量。
紫外—可见分光光度法的依据是朗伯—比尔定律：当一束平行的单色光通过均匀、无散射现象的溶液时，在单色光强度、溶液的温度不变的情况下，溶液对光的吸光度（A）与溶液的浓度（C）及液层的厚度（L）的乘积成正比。朗伯—比尔定律是吸收光度法的基本定律，其数学表达式为：
A=ECL
公式中，C为供试溶液的浓度；E为吸收系数；L为溶液的厚度，即吸收池（比色皿）的厚度，单位为cm，一般无特殊说明时，常用厚度为1cm的比色皿。
在紫外可见的范围内，对于一个特定的波长、吸收的程度正比于试样中该成分的浓度，因此测量光谱可以进行定性分析，而且根据吸收与已知浓度的标样的比较，还能进行定量分析。
二、紫外—可见分光光度计的基本结构
紫外—可见分光光度计，如图所示2-21，是在紫外—可见光区可任意选择不同波长的光测定吸光度的仪器。主要部件包括：光源、单色器、比色皿、检测器、讯号处理和记录系统。
图2-21 紫外-可见分光光度计
1.光源
为了满足在紫外-可见波长范围内进行测定，需要两种光源：①氢灯或氘灯用于紫外区。②钨灯和卤钨灯用于可见光区。
2.单色器
是将光源发射的复合光分解为单一波长光的光学装置。由入射狭缝、出射狭缝、准直镜、色散元件组成。其中，色散元件是其核心部分，早期的仪器多为棱镜，现在多为光栅。
图2-22 石英比色皿
3.比色皿
是用于盛放待测溶液的部件，有两个相互平行的透光面和两个不透光面（如图2-22）。比色皿要求配对使用，匹配的比色皿厚度和透光性应相同。一般有两种材质的比色皿可供选择：①光学玻璃制成的比色皿只能用于可见光区；②熔融石英制成的比色皿适用于紫外光区，也可用于可见光区。
4.检测器
是将光强度转换为电信号的转换器，常用光电管、光电倍增管或光二极管阵列检测器。
5.讯号处理与显示器
讯号处理包括讯号放大、数学运算过程。显示器可进行电表指示、数字显示、荧光显示、结果打印、曲线扫描等。显示方式有透光率、吸光度、浓度、吸收系数等。
三、紫外—可见分光光度计的操作流程
（一）吸收曲线的绘制
1.开机
打开计算机，待系统完全启动后，打开紫外—可见分光光度计主机电源。
2.仪器初始化
在计算机窗口上双击软件图标，仪器进行自检（自检时不得把吸收池上方的盖子打开），大约需要4min。进入人工界面，预热30min。
3.任意选择一个标准溶液浓度，进行光谱扫描
（1）参数设置：光谱扫描窗口下，选择菜单栏上的参数设置，在测量中设置所需参数：波长范围（起始波长大，结束波长小）；测光方式（一般为ABS或T%）；扫描速度（一般为中速）；采样间隔（一般为1nm或0.5nm）；记录范围（一般为0～1）。
（2）基线校正：2个吸收池中都放入空白溶液，单击“基线”进行校正，校完后单击“确定”，取出外池空白溶液。
（3）扫描：外池放入任一浓度标准溶液，单击“开始”进行扫描，得到吸收光谱曲线，单击“波峰”峰值检出，得到几个吸收峰的位置，找到最大吸收峰的波长用作下面的测量。
（二）利用标准曲线测量待测样品含量
1.参数设置
定量测定窗口下，选择菜单栏上的参数设置，在测量中设置所需参数：测量模式（一般为单波长）；输入测量波长；选择曲线方程（一般为c=K0A+K1……）；选择浓度单位。
2.校零
2个吸收池中都放入空白溶液，单击“校零”图标进行校零，校完后取出外池空白溶液。
3.测量标准样品
输入标准样品的编号和浓度，放入第一个浓度的标准样品，将鼠标移到第一个标准样品测量表格，单击“开始”图标。以此类推，将所有标准样品测完。检查标准曲线相关系数R2值情况，一般R2≥0.999的标准曲线方可使用。
4.未知样品测定
外池中放入未知样品，将鼠标移动到未知样品测量表格，单击“开始”图标，即可测出样品吸光值，根据已得到的线性方程和相关系数计算出待测样品的含量。
（三）整理关机
测量完成后，退出软件操作系统，依次关掉紫外-可见分光光度计主机电源、计算机，盖上防尘罩；将比色皿中的溶液倒尽，然后用蒸馏水或有机溶剂冲洗比色皿至干净，倒立晾干。做好使用登记，得到管理老师认可方可离开。
四、注意事项
（1）空白溶液与供试品溶液必须澄清。如有浑浊，应预先过滤，并弃去初滤液。
（2）测定时，除另有规定外，应以配制供试品溶液的同瓶溶剂为空白对照。
（3）一般供试品溶液的吸收度读数，以在0.3～0.7之间的误差较小。
（4）吸收池应选择配对，否则要引入测定误差。在规定波长下2个吸收池的透光率相差小于0.5%的吸收池作配对，在必要的情况时，须在最终测量扣除吸收池间的误差修正值。
（5）由于吸收池和溶剂本身可能有空白吸收，因此测定供试品前要先用配制供试品溶液的同瓶溶剂进行空白校零。
（6）在测定时或改测其他检品时，应用待测溶液冲洗吸收池3～4次，用干净绸布或擦镜纸擦净吸收池的透光面至不留斑痕（切忌把透光面磨损）。
（7）取吸收池时，应拿毛玻璃两面，切忌用手拿捏透光面，以免沾上油污。使用完后及时用测定溶剂冲净，再用纯化水冲净，用干净绸布或擦镜纸擦干，晾干后，放入吸收池盒中，防尘保存。
五、原始记录单
紫外——可见分光光度计准确操作原始记录单
（每场按台架号从小到大排列后装入回收专用袋。）
学 校____，姓 名____，准考证号____
考点名称____，场次号____，台架号____
题目：紫外—可见分光光度计准确操作
1.能准确使用紫外—可见分光光度计，能正确进行原始记录
2.取XX未知溶液，及XX样品溶液，测定吸光值。
操作步骤：
记录人：日期：