实验七 高效液相色谱法测定苯的含量
一、实验目的
（1）会正确使用高效液相色谱仪。
（2）能利用高效液相色谱法测定苯的含量。
二、实验原理
以液体为流动相的色谱法称为液相色谱法，由经典液相色谱（柱层析、纸层析、薄层层析）和气相色谱发展而来，采用高压液体作流动相并采用了新型固定相和连续自动检测系统，从而大大提高了理论塔板数，具有快速、高效、高选择性等特点，特别适用于大相对分子质量的高分子化合物及离子型化合物的分离与分析。因此，人们称这种新型的液相色谱法为高速、高压或高效液相色谱法（HPLC）。
高效液相色谱法按分离原理不同可分为吸附色谱法、分配色谱法、离子交换色谱法、分子排阻色谱法。色谱柱中填充的固定相可以是吸附剂、化学键和固定相、离子交换树脂、葡聚糖凝胶或聚丙烯酰胺凝胶等。实现不同组分分离主要是依靠色谱柱与流动相。待分离的混合物随流动相进入色谱柱后，由于不同组分在固定相与流动相中的吸附力、溶解度、离子交换能力不同而导致流动速度不同，或由于不同组分分子大小不同，流经固定相的途径不同，最终不同组分流出色谱柱的时间各不相同，实现依照一定顺序流出色谱柱而实现分离。
三、器材与试剂
Agilent HP 1100高效液相色谱仪，50μl微量注射器，超声波清洗器；
色谱柱（C18或C8），甲醇（HPLC纯），超纯水，苯标准溶液，混合样品。
四、实验步骤
1.开启仪器
打开计算机，并运行Bootp Server程序；打开1100LC各模块电源；待各模块自检完成后，双击Instrument Online图标，化学工作站自动与1100LC通讯，进入工作站界面。
2.排气泡
流动相过滤、脱气后使用，打开废液阀（purge阀），开启泵（pump on），设定流速“5mL/min”冲洗，直到输液管中无气泡为止，一般需要2～5min，降低流速关上purge阀。
3.条件设定
通过泵设定流动相组成、分析时间及流速；开启检测器灯源，设定检测波长；编辑方法method并保存，从“Run Control”菜单中选择Sample info选项，设定样品名称。
本实验色谱条件：流动相：甲醇：水=80∶20；固定相：Agilent C8（150mm×4.6mm，5μm）不锈钢柱；流速：1.0mL/min；室温；检测波长：254nm。
4.进样分析
预热30min左右，等仪器“Ready”，基线平稳，准备进样；先使六通阀处于装样（load）位置，用微量注射器将样品注入定量环，快速转动手柄至进样（inject）位置，此时仪器会输出一个脉冲，标记开始采集数据。
5.数据处理
（1）试样溶液中的组分的定性：根据标准溶液的保留时间，对试样溶液中的组分进行对比定性确认。
（2）试样溶液中组分含量的计算：根据色谱峰面积（或峰高）测定样品中某一组分的准确含量。常用色谱的定量方法有内标法、外标法和面积归一法等。
6.结束
实验结束后，按要求关好仪器（与开机顺序相反）。
五、注意事项
（1）实验中要求用超纯水，有机溶剂为色谱纯试剂，使用前都必须经微孔滤膜滤过，以除去微粒杂质，并且使用前流动相必须脱气，否则有杂质和气泡进入系统，会影响泵、检测器、柱子，甚至使无法检测。
（2）用微量注射器吸液时，要排气泡。转动六通阀阀芯时不要太慢，更不能停留在中间位置，否则流动相受阻，使泵内压力剧增将损坏柱头。
（3）实验结束后，要注意冲洗，例如ODS柱宜用甲醇冲洗至基线平衡。当采用盐酸缓冲溶液作流动相时，使用完后应用无盐流动相（水）冲洗。
六、分析思考
（1）微粒杂质和气泡对HPLC仪器有何影响？
（2）HPLC实验中手动进样的原理是什么？进样量有何要求？
七、实训报告单附表
高效液相色谱法测定苯的含量原始记录单
（每场按台架号从小到大排列后装入回收专用袋。）
学 校____，姓 名____，准考证号____
考点名称____，场次号____，台架号____
题目：高效液相色谱法测定苯的含量
1.能准确使用容量瓶、吸量管、可见分光光度计，能正确进行原始记录并计算。
2.测定样品中苯的含量。
操作步骤：
记录人：日期：