细胞病理学样本的固定、染色和封片
（一）细胞病理学样本的固定
细胞病理学样本的固定是为防止样本（或涂片后样本）的细胞发生自溶或因细菌作用使细胞发生退变与腐败，并使细胞内各种成分如蛋白质、脂类、糖类或酶类转变为不溶性物质，以保持其细胞原有的结构和相仿的生活状态，从而有利于对细胞形态的观察和细胞性质的判别。固定液和固定方法的选择取决于不同的样本类型、染色方法及对制片速度的要求，不合适的选择直接影响样本的质量。
1.常用的细胞固定方法
（1）湿固定法：该方法对传统涂片的要求为制作完成后立即（在干燥前）浸入固定液，或将固定液即刻喷洒于样本上。在细胞病理学中湿固定法主要与巴氏（Papanicolaou）和苏木素-伊红（hematoxylin-eosin， HE）等常规染色方法配套使用。由于上述染色方法优势在于展示核细节，及时在固定液中固定可避免干燥导致的细胞肿胀、变形、自溶、着色性差及核细节模糊等现象。此外，鉴于配套染色方法的染液穿透力强，湿固定法可用于炎症坏死较多的厚片，因此常用于痰、宫颈、鼻咽、胃肠道和肺支气管等来源的脱落细胞学检查、各类细针穿刺细胞学检查和印片等。应该指出的是，液基细胞病理学制片过程中采用了湿固定方法，且先固定后制片，与传统涂片先涂片后固定的方式相反，优势在于固定及时，但因固定液成分存在差异，部分产品可能致使样本细胞一定程度的收缩变小，镜下形态也略有差异，在诊断时应加以注意。
（2）空气干燥后固定法：指将传统涂片置于空气中常温下自然干燥，随后再经固定液固定的方法。通常配套使用Romanowsky类染色，甲醇为常用固定液。液基细胞学制片因样本采集后即刻转移入有固定作用的保存液中，故而不适合Romanowsky类染色。
2.常用的细胞固定液
（1）95%乙醇固定液：湿固定法中最常用的固定液，固定时间至少15分钟，也可延至数天，并不影响染色效果，但需考虑后续免疫细胞化学和分子等辅助检测对固定时间的要求。该方法适用于湿固定样本或预固定后样本。因乙醇具有溶脂作用，故欲证明胞内含脂质和类脂质时禁用。
（2）乙醚、乙醇混合固定液：95%乙醇与乙醚之比为1∶1。该固定液渗透性强、固定效果好。缺点为易挥发、有异味，应用时要随时盖紧容器，并严防乙醚靠近火源。适用样本和禁忌同95%乙醇固定液。
（3）Carnoy固定液：由95%乙醇（或无水乙醇）60 mL+氯仿30 mL+冰醋酸10 mL混合而成。宜现用现配。适用于固定富含血液的样本。尤适用于显示DNA、RNA、糖原和黏蛋白等的染色，固定3～5分钟，直至样本退为无色，然后可转入95%乙醇或其他固定液中。该固定液中冰醋酸能溶解红细胞，也可防止由乙醇引起的高度收缩。固定时间不宜过长，超过15分钟将影响核着色。
（4）甲醇固定液：直接滴加于干燥涂片上。适用于Romanowsky类染色方法以及免疫细胞化学染色。
（5）50%乙醇固定液：为常用的预固定剂，适用于液体样本的预固定。
（6）10%中性福尔马林：适用于细胞蜡块样本的固定，对于细胞核的结构保存较好。(https://www.daowen.com)
（二）细胞病理形态学检查常用染色方法
样本的染色是为了显示细胞结构，增加各种细胞的分辨度。为达到检查的目的，要严格和熟练掌握各种染色的性质、特点和操作规程，选择合适的染色方法，以准确识别细胞的特征，为诊断服务。细胞病理学检查中应用的细胞化学的种类及方法有数百种之多，本书介绍以下几种常用的染色方法。
1.巴氏染色法
巴氏染色原理与HE染色基于酸碱度的原理相似，细胞核的主要成分是脱氧核糖核酸，其等电点为pH 1.6～2.0，当pH＞2.0时DNA带负电，能与带正电的染料阳离子结合。
苏木素作为染核的染料，氧化后成为氧化苏木素即苏木红或苏木精，它的等离子点是pH 6.5，当染液的酸碱度调节到pH 2.2～2.9时，苏木精能析出阳离子，与带负电的DNA结合。因为苏木精阳离子电荷不强，与DNA结合不牢固，所以染色不深。当加入钾矾等媒剂后，即结合成带强正电的大分子带色体--苏木精矾，后者具有强大亲和力，与DNA结合牢固，染成较深紫色，不易为醇、水洗脱。细胞质中的蛋白质等电点约为pH 6.0，但蛋白质所带正负电荷的多少是随溶液的pH而改变的。在偏碱环境中，蛋白质的羧基游离增多（带负电），当pH＞8时便不再与染料的阴离子结合；在偏酸环境中，蛋白质氨基游离增多（带正电），当pH＜4时便不能再与染料的阳离子结合，因此蛋白质在不同的酸碱度中能与不同的染料结合。EA 36 染液由伊红、亮绿、橘黄及俾士麦棕等染料配成，这些属于酸性染料，在溶媒中其发色团是负离子部分，发色团可与蛋白质中带正电的氨基结合，从而使胞质显蓝色、绿色、橘黄或红色。较年轻的细胞如底层鳞状上皮细胞质中核蛋白体较多，易与亮绿结合而染绿色。成熟的细胞质中含核蛋白体较少（如成熟红细胞、表层角化鳞状上皮细胞），易与伊红结合而染红色。很衰老的细胞（如完全角化细胞）则可与橘黄结合而呈橘黄色。巴氏染色主要用于妇科涂片、痰涂片和富含鳞状上皮细胞的涂片，在针吸细胞学涂片中也被广泛应用。特点是细胞透明度好，细胞核的结构清晰，胞质色彩丰富而鲜艳，因能显示鳞状上皮不同角化程度，可用于阴道涂片测定激素水平；宫颈涂片内分化差的小角化鳞癌细胞显示橘黄色胞质，在红色坏死背景中特别突出，不易漏诊，是妇科涂片理想的染色方法。其显著的优点已使之成为宫颈/阴道细胞学检查涂片的国际通用标准染色法。巴氏染色染液配制、步骤、染色效果及注意事项见附录4，商品化的染液成分及染色步骤参见产品说明。
2.苏木素-伊红（HE）染色法
常规HE染色中苏木素染液的pH约为7，此时细胞核的化学成分电离产生H+，而其本身成为带电荷的阴离子，所以被阳离子型的碱性染料剂所着色。伊红染液为弱酸性。细胞的化学成分从溶液中获取H+而成为带正电荷的阳离子，因此与阴离子型的酸性染色剂（伊红）相结合，染作红色，这就是HE染色分别显示胞核和胞质的机制。HE染色主要适用于针吸细胞学涂片，也适用于浆膜腔积液离心涂片以及含黏液较多和细胞丰富的痰涂片。特点是染色效果稳定、细胞核与细胞质对比鲜明、核的结构清晰、方便与组织学切片对照。尤其近年来细胞蜡块制作技术的发展，HE染色在细胞病理学检查中的作用越来越重要。不过需要指出的是，HE染色与巴氏染色相比较，其色彩单调，不利于上皮细胞成熟度分析，尤其对HPV感染后的特异性着色表现较差，故不推荐在巴氏涂片中使用该染色法。染色试剂配制、染色步骤、染色效果及注意事项见附录4，商品化的染液成分及染色步骤参见产品说明。
3.罗氏（Romanowsky）类染色
Romanowsky类染色包括多种原理相仿的染色方法，例如瑞氏（Wright）、姬姆萨（Giemsa）、Wright-Giemsa、Romanowsky-Giemsa和May-Grunwald-Giemsa（MGG）等 方 法，也包括商品化的快速染色方法迪夫（Diff-Quik）和刘氏（Riu）染色等。该类染色主要原理和步骤为：经空气干燥后，于甲醇固定液固定，随后使用中性染料染色，后者由酸性染液（主要为伊红）和碱性染液（主要为亚甲蓝/天青乙）组成。Romanowsky类染色早期主要用于血细胞分类，除血液病理学外，目前也是非妇科细胞学的常用染色方法，染色特点为侧重展示细胞外形轮廓、胞质和细胞外物质等的特征，但对于炎症坏死过多或过厚的涂片染色效果不佳。迪夫和刘氏染色等因快速而常用于ROSE。常见的Romanowsky类染色试剂、染色步骤、染色效果及注意事项见附录4，商品化的染液成分及染色步骤参见产品说明。
（三）封片
涂片染色后，经过一系列的脱水透明进行封片，可手工或用封片机完成。以下手工封片步骤仅供参考：用无纤纱块擦净薄片背面的二甲苯，向每片片面滴0.05～0.1 mL中性树胶，用24 mm×32 mm或24 mm×50 mm盖玻片封盖。封盖要求：中性树胶必须适量，放盖玻片时应轻柔斜盖表面，致完全封盖细胞圈为止，避免出现气泡。所有玻片封固后放到通风橱内晾干或放置在烤片箱中以35～40℃烤片1～2小时。