附　录

附　录

附录1 · 知情同意书（仅供参考）

××××医院病理科

针吸细胞病理学检查知情同意书

姓名________ 性别________ 年龄________ 科别________

病区床号________ 住院号/门诊号________ 联系电话________

您好！欢迎您选择我室为您做细胞病理学检查。

细胞病理学诊断是以疾病形态学为基础的诊断项目，其结果作为临床医师确定病变性质、指导治疗方法的重要依据，有较高的临床意义，但细针穿刺是一项微创性检查，且检查结果具有一定局限性，请您在检查前请认真阅读此单，对此项目检查您需要对下述基本情况进行知情。

一、 禁忌证：检查前需告知既往是否有如下疾病史。

1. 中至重度心脏病、心绞痛及心力衰竭患者；重度高血压及脑血管病变。

2. 出凝血机制障碍。

3. 严重哮喘及呼吸衰竭。

4. 体质极度虚弱、恶病质。

5. 精神、神经障碍患者及重度癫痫。

6. 创伤失血正在急救等。

7. 其他不适或疾病不适合检查的。

二、 并发症

细针穿刺细胞学检查系微创检查，但人体结构的特殊性和疾病的复杂性是不可预测的。最小的创伤也可能会引起不良的后果，针吸操作过程中有一定概率会出现以下并发症：① 局部出血；② 疼痛；③ 晕针；④ 低血糖反应；⑤ 心慌、气短等不适症状；⑥ 诱发癫痫发作；⑦ 原有寄生虫病基础上引发的过敏性休克；⑧ 颈部或其他部位的神经鞘肿瘤，颈部穿刺时涉及神经鞘组织时，可出现酸、麻、痛感觉，并多放射至上肢手梢部位，多为一过性，个别患者可持续一定时间；⑨ 胸部及锁骨上针吸时，患者配合不佳或因注射器塞芯与抽芯脱离而引起针头进入胸腔，造成气胸等；⑩ 其他不可预测的情况。

如果有以上情况者请及时告知医生或检查者，我们将针对不同的情况采取相应的应对措施。

三、 检查后注意事项

1. 检查完毕后需在候查处静坐30分钟以上才能离开。

2. 检查后发现严重晕厥、胸闷气急、呕血、黑便等不适请及时就诊。

3. 检查后避免重体力活动及污物接触针吸部位。

4. 一般情况下检查后一个工作日内取报告单，特殊检查需顺延。

四、 检查的特殊性

1. 细胞病理学检查属于治疗前或术前检查，是一种小样本的抽样检查，有其局限性，即检查的敏感度在70%～90%，特异性在90%～95%。为保证穿刺检查质量，有时还需重复检查。

2. 细胞病理学检查由于有以上不足，其结果仅供临床医师综合分析病情时参考，不能单独作为器官或肢体切除的最终依据。

3. 作为教学医院，在不违反诊疗操作规范和基本资质条件要求并保证医疗质量前提下，允许进修、实习医师在带教医师指导下参加必要的操作。

了解以上情况后，您还愿意做此项检查吗？如愿意，请签字或按手印确认，谢谢合作。

患者签字（或手印）：

委托签字者签字：　　　　　　　　　与患者关系：　　　　　　　签字日期：20 年　月　日

检查医生签字：　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　签字日期：20　年　月　日

附录2 · 常用细胞学样本采集方法（仅供参考）

根据检查部位、检查项目和检查目的的不同，细胞学样本采集方法可分为脱落细胞学和细针穿刺细胞学两大类别。所谓“脱落细胞”指从体表、体腔或与体表相通的管道内自然脱落、分泌或经一定器械作用脱落的浅表细胞。常见脱落细胞学样本包括宫颈/阴道/肛管涂片、痰涂片、皮肤/乳晕/口腔黏膜刮片、食道拉网涂片、内窥镜刷片/冲洗液/灌洗液、乳头溢液、尿、浆膜腔积液、胸盆腹腔冲洗液等液体样本沉渣涂片和组织学样本（空芯针穿刺/淋巴结/鼻咽活检）印片等。细针穿刺指使用外径一般不超过0.7 mm（22 gauge及以上）的细针刺入肿块内获取细胞的方法。对于淋巴结、涎腺、甲状腺、乳腺、皮肤和软组织肿块等其他体表可触及的肿块可在触诊引导下进行穿刺。对于难以触及的深部肿块或体表可触及的性质不均一的肿块，例如囊性肿块或囊实性肿块等，可经超声、超声内镜及CT等影像学技术引导下穿刺。以下介绍经常由病理科或患者自行操作的常用细胞学样本采集方法和注意事项。

1.痰

通常由患者通过咳痰留取新鲜痰样本送检。正确咳痰方法为晨起清洁喉咙和口腔后，用力从肺深部咳痰3～4口至痰瓶内，应避免仅留取唾液。取材应挑选痰液中带有血丝的部分或灰白色痰丝。

2.尿

包括由患者自行获取的自然排空尿和临床医师通过器械方法获取的尿（导管尿、膀胱冲洗、上尿路冲洗等）以及回肠代膀胱术后的尿等，因此送检需注明尿液类型。自然排空尿连续送检有助增加检出机会，无需首次晨尿，虽然首次晨尿中细胞数量更多，但因长时浸泡于尿液中易退变，不利于形态观察。女性易收集中段尿以避免阴道鳞状上皮污染。

3.皮肤或黏膜刮片

使用消毒竹签、刮板、手术刀片和针头等轻刮患处，将刮取物均匀涂片。

4.乳头溢液

乳头溢液可见于单或双侧乳房的单个或多个输乳管开口，可为乳汁样、水样、浆液性、脓样或血性。往乳头方向轻轻按摩乳房，并用清洁载玻片轻触乳头表面溢出的液滴，均匀涂片，并记录溢液的大体性状和发生溢液的导管数量。

5.细针穿刺

以触诊引导下负压吸取穿刺为例说明采集方法。经触诊明确肿块部位后，使用非优势手手指固定肿块，另一手消毒肿块后将连接5～10 mL一次性注射器的细针头刺入肿块，随后拉出针芯以维持负压吸取，迅速抽提针头若干次，同时保持针尖于肿块内且不改变进针方向。若需改变进针方向，要将针头退出肿块至皮下后，改变角度再进针，否则将人为导致针道拓宽，增加损伤和肿瘤播散危险。抽提毕释放负压，随后将针头完全退出于皮肤外，棉球压迫止血。

附录3 · 特殊细胞学样本的制片（仅供参考）

1.血性样本

（1）适用范围：血性浆膜腔积液、尿液及其他富含血液的液体样本。

（2）预处理方法：血性送检液静置30分钟后，轻轻将送检液上部分倒掉，取下层液体至离心管。第一次离心沉淀（2 500～3 000转/分钟，3～5分钟）。弃去上清液（若沉淀物呈红色且量很多，则应用吸管吸掉上清液，以免沉淀物一并倒出），取沉淀物上层细胞加入适量乙醇冰醋酸液（5%～10%冰醋酸，25%乙醇），置振荡仪上振荡（1 500振/分钟，10分钟）。第二次离心沉淀（1 000～1 500转/分钟，5～7分钟），若沉淀物肉眼视仍有较多血液，则重复清洗。弃去上清液，吸取沉淀物制片。

2.黏液性样本

（1）适用范围：常用于痰液和支气管毛刷样本等。

（2）预处理方法：主要目的为消化黏液，根据样本量及样本的黏稠程度向样本中加入1，4-二硫苏糖醇（DTT）液（10～20 mL的蒸馏水加1 g的DTT冷藏保存）适量，置振荡仪上振荡（1 500振/分钟，10～30分钟）至肉眼未见黏液丝即可。

3.细胞量少样本

（1）适用范围：常用于尿液、脑脊液、支气管灌洗液和腹腔冲洗液等样本。

（2）预处理方法：采用多次重复离心沉淀方法以富集细胞。送检液静置30分钟后，轻轻倒去上层液体，剩余液体混匀后，倒入离心管中，进行第一次离心，弃去上清液，同支离心管再倒入送检液，第二次离心沉淀，视沉淀物多少决定有无必要继续加送检液离心沉淀，弃去上清液，吸取沉淀物制片。

4.传染性样本

（1）适用范围：如结核穿刺液、痰液及其他传染性样本。

（2）注意事项：在风险评估的基础上，按不同级别的防护要求和实际操作的需要选择适当的防护装备。具有所需要的生物安全防护水平相适应的设备，包括个人防护用品（隔离衣、帽、口罩、鞋套、手套和防护眼镜等），实验操作在生物安全柜中进行。可使用甲醇液固定样本，其具有抗菌、抗病毒的效果，在15分钟内使99.99%以上的细菌和病毒灭活，包括白念珠菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌（绿脓杆菌）、金黄色葡萄球菌、结核杆菌、痘病毒和艾滋病病毒等。

附录4 · 细胞学常规和特殊染色常用染液的配制、染色 步骤、染色效果及注意事项（仅供参考）

1.巴氏染色

（1）试剂配制

1）苏木素液：常用Harris苏木素液（附表4-1）或Gill改良苏木素液（附表4-2）。

2）盐酸-乙醇液：见附表4-3。

附表4-1　Harris苏木素液配方

附表4-2　Gill改良苏木素液配方

附表4-3　盐酸-乙醇液

3）稀碳酸锂液：在100 mL蒸馏水中，加饱和碳酸锂1滴。

4）橙黄G6液：见附表4-4。

附表4-4　橙黄G6液

5）EA染液：常用EA36染液（附表4-5）或EA50染液（附表4-6）。

附表4-5　EA36染液配方

附表4-6　EA50染液配方

（2）染色步骤

1）95%乙醇溶液固定10～15分钟。

2）清水冲洗1分钟。

3）苏木素染核3～5分钟，如用Harris苏木素，必要时进行分化，即盐酸-乙醇液分化20～30秒，至涂片呈淡橙红色，取出流水漂洗干净。

4）用水或碱水反蓝，碱水反蓝需再入清水冲洗以去碱液，比如：稀碳酸锂溶液蓝化2分钟，涂片变蓝色，流水漂洗干净。

5）95%乙醇溶液脱水。

6） 橙黄G6液浸泡10秒。

7）95%乙醇两道漂洗。

8）EA36液或EA50液浸泡30～60秒。

9）95%乙醇两道漂洗。

10）无水乙醇两道脱水。

11）二甲苯两道透明。

12）中性树胶封片。

以上染色步骤仅供参考，具体根据环境温度、湿度及染液的使用情况及时调整。

（3）染色结果：细胞核呈深蓝色，核仁更深带紫，鳞状上皮底层、中层及表层角化前细胞胞质染淡绿色，表层不全角化细胞胞质染粉红色，完全角化细胞胞质呈橘红色，红细胞染鲜红色，白细胞的胞质呈淡蓝绿色，黏液染淡蓝色或粉红色。

（4）注意事项

1）如前染色原理所述，EA36染液的酸碱度对巴氏染色的成功起着关键性作用，必须把染液pH调至5.2为宜。EA36染液pH的测试，可用石蕊试纸法或酸度计法并以酸度计法最为准确。

2）许多人使用10%磷钨酸及饱和碳酸锂溶液直接测试，方法简便且同样可获得满意的染色效果。具体做法是，拿一张滤纸先滴少量染液于纸上，若滴染液处呈紫色，说明染液偏碱，则滴加少量10%磷钨酸。若显绿色，说明染液偏酸，则滴加少量饱和碳酸锂，并充分混匀，直至染液滴在纸上既显绿色又有红色，颜色鲜艳为宜。

3）磷钨酸在染色过程中，不但作为媒染剂可增加染料的着色力。同时磷钨酸与碳酸锂还是一对弱酸弱碱，作为缓冲剂可中和分色及蓝化时可能留下的少量酸或碱，保证染色达到理想效果。若涂片经EA36染色后，镜下观察效果不理想时。根据涂片着色情况，可于EA36染液中滴加少量10%磷钨酸或饱和碳酸锂后重染EA36 3～5分钟而补救。若角化细胞质不红，可滴加10%磷钨酸。若角化前细胞质也变红，可滴加饱和碳酸锂如此边复染边镜下观察，直至获得最佳染色效果为止。

4）分色或酸化，对染色效果也很重要。经分色后的胞质在镜下观察应以无色为佳。若胞质中还残留有苏木素染料，则影响EA36染液的着色。分色时间不过短或过长，每次宜在数秒内完成。盐酸浓度以0.5%为好，以便于掌握分色的时间。

5）经过蓝化或碱化，胞核紫中带蓝与红色的胞质对比明显。蓝化所用的碳酸锂是一种弱碱，还可中和分色时可能残留下的少量盐酸，为EA36的着色创造良好条件。因此蓝化时间可适当长些，以肉眼观察涂片变蓝为好。

6）EA50染液配方稍复杂，但不易沉淀，染色效果较EA36稳定。

7）每个染色步骤结束之后把涂片架在纸巾上放置几秒，不使用时将染液保存于棕色瓶中，盖上染色缸，可延长染液的使用寿命。

8）苏木素的特性相对恒定，很少需要更换，当量不足时可适当补充新鲜染液。

9）橙黄G6和EA比苏木素损耗的快，应每周更换，或当细胞出现灰色、模糊或对比不鲜明时应更换。

10）水洗液应该在每次使用后更换。

11）乙醇应经常使用比重计测量浓度，并每周更换一次，以代替过滤。细胞质染色后的乙醇漂洗液应每使用一轮后更换。无水乙醇应每周更换一次，可加入Silica Gel片剂，以保持无水乙醇的无水。

12）二甲苯应该在颜色变浅时更换，含水的二甲苯会呈乳白色。无水乙醇中加入Silica-Gel片剂可降低二甲苯被水污染的程度，这种片剂也可加入二甲苯中，吸收二甲苯中的水分。

13）有人使用50%、70%、80%、95%乙醇梯度水化以减少细胞的破坏。但Gill使用一步法替代水化，细胞破坏未见增加。

14）污染控制：苏木素、EA、橙黄G6应该每天至少过滤一次，尤其是在对含癌细胞的涂片进行染色后。妇科样本与非妇科样本应分别染色。为避免交叉污染，建议将富含癌细胞的，以及公认的易于脱落的细胞涂片单独染色。一旦发生了交叉污染，所有的染料和溶液必须全部过滤或丢弃。

2.HE染色

（1）试剂配制

1）苏木素染液、盐酸-乙醇液和稀碳酸锂液（具体参见巴氏染色章节）。

2）伊红：见附表4-7。

附表4-7　伊红染液

（2）染色步骤

1）将已固定的涂片蒸馏水洗15分钟。

2）Harris苏木素染色1～2分钟，取出后流水漂洗干净，直到除去多余的染色剂，大约1分钟。

3）0.5%盐酸乙醇浸泡2～3次，或直到涂片变为红色，然后流水冲洗30秒。

4）稀碳酸钾溶液蓝化1分钟，涂片变蓝色，流水漂洗干净，约15分钟。

5）50%乙醇浸泡15分钟。

6）伊红染色大约20秒，流水冲洗直到除去多余的染色，大约15分钟。

7）脱水、透明、封固（具体参见巴氏染色章节）。

以上染色步骤仅供参考，具体根据环境温度、湿度及染液的使用情况及时调整。

（3）染色结果：细胞核呈深蓝色，胞质呈淡玫瑰红色，红细胞呈淡红色。

（4）注意事项

1）染色时应保持各试剂和染液的清洁和纯净。染液中如有沉淀或碎渣应及时过滤，苏木素染液如表面有金黄色结晶应在用前刮去。

2）苏木素染色时间应根据染液的新旧、染液对细胞着色力的强弱和室温条件灵活掌握。新配染液，首次染色时应镜下观察染色效果。

3）盐酸分化的掌握是染色成败的关键。如分化不当，导致细胞着色不均。以肉眼观察颜色呈鲜紫红色为好。

4） 蓝化要充分。为防止对伊红液的拒染，应流水充分漂洗或用自来水加温蓝化。

5）伊红着色要适中，不宜过深或过浅，以致核浆模糊不清。

6）染色后，乙醇脱水要充分。若涂片入二甲苯出现混浊或云雾状，系脱水未尽，应退回重新脱水。

7）封片时，冬天要注意口鼻呼出的热气不要接触到载玻片，同样在潮湿的季节，封固动作必须迅速，以避免空气中的水分进入封固剂，影响镜检和涂片久存。

8）近年来，HE全自动染色机的应用渐广。应当指出使用无需分化的进行性苏木素染液更为适宜，比如Mayer苏木素等。

3.姬姆萨染色法

姬姆萨（Giemsa）法染色液是天青色素、伊红、次甲蓝的混合液。姬姆萨染色使细胞核着色较好，结构显示较清晰，并能较好的显示胞质的嗜碱性程度，特别对嗜天青、嗜酸性、嗜碱性颗粒着色较清晰，色泽纯正。最适于血液涂片，用以染血球、疟原虫、立克次体以及骨髓细胞、脊髓细胞等的染色。在光镜下呈现出清晰的细胞及染色体图像。

（1）试剂配制

1）Giemsa原液：见附表4-8。

附表4-8　Giemsa原液

2）Giemsa工作液：将5 mL Giemsa原液与65 mL水混合。

近年来的改进配方见附表4-9、4-10、4-11。

附表4-9　Giemsa原液改进配方

附表4-10　Sorensen缓冲液（pH 6.81～7.38）改进配方

附表4-11　Giemsa工作液改进配方

（2）染色步骤

1）蒸馏水冲洗15下。

2）Giemsa工作液浸泡2小时。

3）1%醋酸很快洗1下。

4）吸水纸吸干。

5）100%甲醇，直到只有轻微蓝色从涂片进入甲醇液中再取出涂片。

6）二甲苯Ⅰ、Ⅱ各洗10下，中性树胶封片。

（3）染色效果：细胞核呈紫蓝色或深紫色，胞质呈粉红色，其中嗜酸性颗粒粉红色，嗜天青、嗜碱性颗粒紫蓝色或深蓝色。红细胞橙黄色或浅红色。淋巴细胞紫蓝色。(https://www.daowen.com)

（4）注意事项

1）有报道将自然干燥的细胞涂片滴加数滴甲醇预固定10分钟，或用1∶3醋酸/甲醇固定30分钟。

2）Giemsa工作液，稀释后液面应浮露金黄金属光泽，表示染液起了作用，否则染色失败。

3）改进Giemsa工作液可缩短染色时间至10～15分钟，但染色液宜现用现配，保存时间不超过48小时。

4）改进Giemsa工作液所用缓冲液pH要准确，否则影响染色效果。

5）用染色缸染色前应先用小片滤纸刮除液面的氧化后，再进行染色。

6）染色后可用多量蒸馏水急速冲洗，以免沉淀物沾污涂片，不能洗脱。

7）染色过深，可表现为镜下细胞变小，细胞核与细胞质均呈深蓝黑色，结构不清，红细胞呈碱性色。可能原因：染色时间过长，染液过多或染液偏碱，夏季染色过程中甲醇挥发。染色过浅，可表现为：胞质内颗粒及核均不着色或着色过浅，红细胞亦不着色。可能原因：染色时间过短，染液过少或染液偏酸。

8）如染液过碱，可于其中加1%醋酸少许，或将涂片浸于95%乙醇中数秒，然后冲洗。染色偏酸较少见，可新旧染液混合使用，借以调整其pH，或于染液中加2%碳酸钠适量。

9）染前用蛋白酶等进行处理，再行姬姆萨染液染色，在染色体上可以出现不同浓淡的横纹样着色。

4.改良May-Grunwald-Giemsa（MGG）染色法

MGG染液由迈-格氏（May-Grunwald）染料（化学名为曙红亚甲基蓝Ⅱ，即伊红美蓝）及姬姆萨（Giemsa）染料两种成分混合配制而成。前者对胞质着色较好，后者对胞核着色较好，两者合用兼有两种染色的优点，又省去了原法染液分别配制、分别染色之麻烦。

（1）试剂配制

1）May-Grunwald试剂：见附表4-12。

2）Giemsa液：见附表4-13。

附表4-12　May-Grunwald试剂

附表4-13　Giemsa液

（2）染色步骤

1）May-Grunwald工作液浸泡5分钟。

2）流水冲洗1分钟。

3）Giemsa工作液浸泡15分钟。

4）流水冲洗1～2分钟。

5）空气干燥，不用封片。

（3）染色效果：细胞核呈蓝色，胞质粉红至玫瑰色，细菌蓝色。

（4）注意事项

1）有报道将自然干燥的细胞涂片滴加数滴甲醇预固定。甲醇具有强大的脱水力，可将细胞固定在一定形态及增加细胞结构的表面积，提高细胞对染料吸收作用，同时由于甲醇吸附染色液中的水，使染色液升温，加速染色反应。

2）染色时间常与染液用量及室温有关，室温高染液用量多，时间短，几分钟即可染完。一般用2～3滴染液加1～2倍缓冲液稀释，染色20～30分钟即可。涂片中多黏液及脂肪时，应延长染色时间。

3）宜镜下观察控制染色时间，以取得最佳效果。MGG染色过深时，可滴几滴甲醇并将涂片稍作倾斜、晃动片刻，再用自来水轻轻冲洗，即能达到染色变浅的目的，且减轻背景颜色，观片更清晰。染色过浅时，重新染色并延长时间即可。

4）因某些原因未经酒精固定就已干燥了的较薄细胞涂片，不适宜做HE染色，如改做MGG染色，则是很好的补救办法，有助于诊断。

5.Romanowsky-Giemsa染色（R-G染色）

1978年Wittekind等指出用纯天青B及伊红Y可得到完美的Romanowsky-Giemsa染色（R-G染色），亚甲蓝可省去，这项工作已被Galbraith（1980）、Marshall（1981）和Lapen（1982）重复证实。应用显微分光光度计显示，R-G染色之后，核有3个吸收波段：A1（15 400/cm，649 nm）、A2（16 800/cm，595 nm），这是DNA与天青B的单体及二聚体结合的结果；第3个吸收波段称为RB（18 100/cm，552 nm），被认为是DNA-高聚合天青B-伊红Y的复合物，也就是Giemsa染色中细胞核呈紫色的基础。胞质染色的吸收光谱也有3个带（pH≈7）：A1（15 300/cm，654）、A2（16 900/cm，592 nm）及A3（17 600/cm，588 nm）。出现这3个波段的原因也被归因于RNA与天青B的单体、二聚体或多聚体结合的结果。将“标准”液染色后的各种血细胞进行色泽分析，结果发现纯天青B及伊红Y两种染料各有两个聚合状态（单体和二聚体）。这4种成分在各个血细胞的结构中的比例不同，因而形成血细胞多色彩的表现。

（1）试剂配制：见附表4-14～4-16。

附表4-14　R-G贮存液

附表4-15　羟乙基哌嗪乙硫磺酸（HEPES）pH 6.5缓冲液

附表4-16　R-G工作液

（2）染色步骤

1）涂片常规甲醇固定。

2）入R-G工作液，血片染10～30分钟；骨髓片染15～35分钟。

3）过缓冲液。

4）过蒸馏水。

5）晾干，有价值的片可二甲苯透明，封片后永久保存。

（3）染色结果：细胞核依细胞成熟度不同而呈梯度染色改变，在以往专著中各种颜色如Digg等描述为亮红到深蓝，Miale认为是紫色到蓝色，Wintrobe则形容为紫红色到蓝紫色。胞质呈粉红色。

（4）注意事项

1）湿片固定和空气中晾干的样本的R-G染色有差别，空气中晾干对核着紫色有稳定作用。

2）pH对R-G染色的影响，类似Giemsa染料的pH对红细胞色泽的影响，pH低时，伊红着色，pH高时呈蓝绿色。由于天青B仍与负电荷结合，pH 7～8时，R-G效果中的紫色深于pH 6～5时，当pH 3.5时，R-G效果全部抑制，只出现2种颜色即蓝绿色的核和红色的细胞质。

3）缓冲液成分对染色结果也有影响，其中以HEPES缓冲液pH 6.8效果最好，这是由于二价酸的盐效应较好，它不与组织中阳离子形成不溶性化合物。当缓冲液浓度达到0.05 M时，R-G染色变浅。

4）劣等的甲醇和乙醇对R-G的影响极大。由于DMSO有利于天青B-伊红Y复合物的稳定，能溶解多量伊红Y，不挥发，毒性低，易与甲醇及水混合，并对空气中干燥红细胞的耐受性优于甘油，因而被用来代替甘油。

5）由于染色后细胞中各种成分的不同色泽取决于天青B（单体及二聚体）和伊红Y（单体及二聚体）4种成分的比值。因此染液中天青B与伊红Y的比值必然影响染色结果。用纯天青B和伊红Y的重量比为15∶1时可得到外周血和骨髓的满意的血细胞染色。建议采用安全比例，即碱性染料的量超过酸性染料。

6）Horobin（1987）研究R-G染色的时间影响，当延长染色时间到28小时，结果所有细胞成分均染成紫色。故R-G染色中的紫色选择性只是一个反应速度现象（附表4-17）。

附表4-17　R-G染色出现问题的可能原因

6.Diff-Quik染色

Diff-Quik实际是一种染色快速的商品化Romanowsky类染色方法。Diff-Quik溶液Ⅰ包含伊红。Diff-Quik溶液Ⅱ包含天青A和亚甲蓝（美蓝）。亚甲蓝是一种不纯的染料，容易氧化为一、二、三甲基硫堇等次级染料。因此，用本染料液染色后，在同一涂片上，可以看到各种不同的色彩，例如血红蛋白，嗜酸性颗粒为碱性蛋白质，与酸性染料伊红结合呈粉红色，称为嗜酸性物质；细胞核蛋白和淋巴细胞胞质为酸性，与碱性染料亚甲蓝或天青结合呈蓝色，称为嗜碱性物质；中性颗粒呈等电状态与伊红和亚甲蓝均可结合而淡紫色，称为中性物质。Diff-Quik是商品化的试剂，最早用于鉴别寄生虫，近年来发现此类染色对细针穿刺细胞学检查（FNAC）实用价值巨大，由于其快速、简单且可永久保存，可作为FNAC样初查，鉴定细胞数量多少，穿刺质量好坏的快速手段。

（1）试剂配制：见附表4-18、4-19。

附表4-18　Diff-Quik染液

附表4-19　醋酸乙醇液

（2）染色步骤：可严格按商品化的试剂说明进行，主要步骤如下。

1）甲醇固定（空气干燥后）或直接入Diff-Quik固定液1分钟。

2）入伊红缓冲液即Diff-Quik溶液Ⅰ 2分钟。

3）入亚甲蓝缓冲液即Diff-Quik溶液Ⅱ 4分钟。

4）蒸馏水快速浸洗2～3次，每次1～2秒。

5）用醋酸乙醇液漂洗1～2秒。

6）蒸馏水浸洗2～4次，每次5秒。

7）水洗后即刻湿片镜检。

8）晾干，有价值的片可二甲苯透明，封片后永久保存。

（3）染色结果：细胞核呈蓝色，胞质、胶原、肌纤维呈多色调的蓝色和粉红色，细菌包括幽门螺杆菌呈深蓝色，真菌（包括霉菌、酵母菌和伞菌等）呈深蓝色。

（4）注意事项

1）Diff-Quik染色的注意事项类似于Giemsa染色和R-G染色。

2）相比而言Diff-Quik染色在染色时间上具有明显的优势，且Diff-Quik染色后的涂片不需脱色即可进行巴氏染色。

3）在同一张染色片中偶见染色程度的差别，尤其对于未经处理的黏稠度较高、碎屑较多的样本，Diff-Quik染色后的背景差，可能严重影响正常的形态学评估。

4）由于细胞染色对氢离子浓度十分敏感，冲洗用水应近中性，冲洗应快速，否则可导致各种细胞染色反应异常，以致识别困难。

5） 建议使用Diff-Quik染液一周后废弃，平均每日可染片20～30张。

6）Diff-Quik染色可应用于组织切片，幽门螺杆菌感染的胃组织或任何感染革兰阴性菌属如大肠埃希菌的组织片可染色阳性对照。

7.PAS染色

PAS（periodic acid schiff）染色是一项极其有用而应用广泛的技术，其原理是含有乙二醇基或氨基烷基氨衍生物的物质（绝大多数为多糖分子）被过碘酸氧化为双醛，双醛与Schiff试剂（无色品红液）结合，形成不溶解的洋红色复合物。对这种染色呈阳性反应者包括糖原及含有多糖分子的一大类物质（详见参考《病理规范》），为了进一步鉴定和区分这些物质，可通过一系列酶消化对照、阻断反应和其他染色技术作为补充手段。

（1）试剂配制：见附表4-20～4-25。

附表4-20　0.5%过碘酸水溶液

附表4-21　无色品红试剂（Schiff试剂）

附表4-22　偏重亚硫酸钠溶液

附表4-23　Pal漂白粉

附表4-24　固绿FCF

附表4-25　Weigert铁苏木精

（2）染色步骤

1）经95%乙醇固定的涂片蒸馏水冲洗15下。

2）过碘酸浸泡10分钟。

3）自来水冲洗10分钟后，蒸馏水浸泡15分钟。

4）品红试剂浸泡15分钟。

5）偏重亚硫酸钠Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ各浸泡2分钟。

6）自来水冲洗10分钟。

7）Weigert苏木素浸泡4分钟后，自来水冲洗5～10分钟。

8）Pal漂白粉漂白1下后，自来水冲洗5分钟后，蒸馏水冲洗15下。

9）固绿1下。

10）95%乙醇和无水乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。

（3）染色结果：所有的糖原和真菌呈红色，细胞核呈蓝色，背景绿色。

（4）注意事项

1）淀粉酶消化的PAS染色，除在过碘酸-雪夫反应（PAS）染色过程中第2步之前将涂片放入淀粉酶溶液中消化20分钟外，其余染色过程同PAS染色。

2）淀粉酶溶液：麦芽糖淀粉酶（美国药典）0.5 g，蒸馏水100 mL。

3）所有的含糖成分，包括糖原、原菌，在标准PAS染色涂片中均为PAS阳性（碱性品红红色）。糖原在淀粉酶处理的涂片中不染色。

4）试剂配制过程中所用玻璃器皿均要求化学洁净。

5）试剂要求高纯度，碱性品红以分子量337.85，并注明亚硫酸钠实验合格者为佳，偏重亚硫酸钠应有较浓的刺激性硫气味。

6）Schiff液中含有足够的SO2，可使试剂保持稳定，故Schiff液宜用小口磨砂瓶严格避光保存于4℃冰箱。

7）无色品红建议滴染，用后即弃。若溶液呈淡红色，应弃之不用。

8）控制过碘酸氧化（浓度0.1%～0.5%，时间8～10分钟），可较少产生人为假象。

9） 宜用Weigert苏木素浅染或不复染。

10）糖原易溶于水，固定前不能用水洗，宜将细胞涂片直接置于固定液中。

8.抗酸染色

抗酸染色有辅助识别抗酸杆菌的作用。抗酸杆菌属分枝杆菌，常见的为结核杆菌和麻风杆菌。抗酸杆菌的细胞壁中富含脂质成分（分枝菌酸和长链脂肪酸），能结合碱性染料（如苯甲烷染料碱性品红和新品红）并抵抗酸-乙醇的强脱色作用。显示抗酸杆菌传统采用Ziehl-Neelsen法，染液中采用无水乙醇最大限度地溶解碱性品红，并以苯酚作媒染剂，提高染料的染色性能，使苯酚碱性品红（又称石炭酸品红）与抗酸杆菌牢固结合。现以Ziehl-Neelsen法为例说明。

（1）试剂配制

1）苯酚碱性品红液：见附表4-26。

2）3%盐酸水溶液或3%盐酸乙醇。

3）0.1%亚甲蓝水溶液或碱性亚甲蓝溶液即：亚甲蓝乙醇饱和溶液加0.01%氢氧化钾。

附表4-26　苯酚碱性品红液

（2）染色步骤

1）入苯酚碱性品红液60℃温箱中1小时，或滴加石炭酸复红溶液布满涂片加热至染色液出现蒸汽，时间为3～4分钟。

2）流水洗去多余染液。

3）滴加3%盐酸乙醇脱色，至涂片呈淡粉红色为止，流水冲洗。

4）滴加0.1%碱性亚甲蓝溶液，复染10～30秒，直至1分钟。

5）95%乙醇分色5～10秒。

6）脱水、透明、封固。

（3）染色结果：抗酸杆菌呈鲜红色，杆状，略弯曲，散在或成簇分布，细胞核及背景呈淡蓝色。

（4）注意事项

1）苯酚碱性品红液易出现沉淀，滴染时应过滤或小心吸取上清液。配制时可将其中碱性品红配成碱性品红乙醇饱和液10 mL。

2）染色可进行加热处理，以促进染液对菌体穿透，作用时间可延长至11小时不等。

3）3%盐酸乙醇脱色应在镜下控制至杆菌显示清晰。

4）对于专门用来证实抗酸菌时，推荐使用Zenker固定液。

5）抗酸性取决于细菌细胞的完整性和其中所含脂质。改良Wade-Fite法不经乙醇脱水，可避免破坏菌体内的脂质。麻风杆菌的抗酸性甚弱，在适合于显示麻风杆菌的Wade-Fite法中，以硫酸代替盐酸液作分化剂。

附录5 · 用于分子检测的细胞学样本目标细胞评价方法 （以肺癌靶向基因检测为例，仅供参考）

1.传统涂片直接用于肺癌靶向基因检测

传统涂片明确诊断之后，评估HE染色片上的肿瘤细胞数量，如果肿瘤细胞数量大于200个，则可以用一次性刀片刮取细胞涂片上的细胞到1.5 mL的离心管中，然后进行核酸提取，可以用PCR或者NGS方法进行靶向基因检测。

传统涂片用于分子检测的优点是核酸质量优，肿瘤细胞计数明确，不足之处是固定剂和染色剂可能影响核酸纯度，但是不影响基因检测结果，对于要求高的分子检测技术需要脱染色剂之后再使用。

传统涂片用于分子检测有几个关键点：① 细胞固定需要快速、均匀；② 同时多制备几张涂片，预留诊断用存档涂片；③ 需要用独立的刀片刮片和独立的二甲苯溶液脱盖玻片。

传统涂片除了可以用于PCR、NGS检测之外，还可以用于FISH检测。评估细胞涂片上肿瘤细胞的数量大于100个，载玻片反面标记肿瘤细胞区域，轻轻移去盖玻片，同组织FISH操作流程一样，仅仅在消化时间上少于组织学样本，就可以获得较好的FISH检测结果。细胞涂片用于FISH检测的优势是细胞非常完整，容易被消化，无纤维类组织结构和杂质，背景清晰；劣势是部分肿瘤细胞成团出现，不易消化分离，肿瘤细胞叠加会影响判读。

2.液基细胞学样本用于肺癌靶向基因检测

制作形态学诊断用的液基片之后，剩余的液基细胞学样本，核酸质量比较好，能够用于PCR和NGS检测。上海市肺科医院病理科综合细胞HE染色涂片肿瘤细胞数量和肿瘤沉淀大小两个因素，建立了剩余液基细胞样本分子检测前的评估体系，如附表5-1所示，可供参考。

3.细胞蜡块用于肺癌靶向基因检测

细胞学样本如果沉淀比较多，可以制作成细胞蜡块，和手术石蜡样本一样，用于后续的FISH、PCR和NGS等各种分子检测。

附表5-1　液基细胞学标本检测结果与HE 染色涂片检测结果比较