附录D（规范性附录） 临床微生物检验领域质量管理要求
1 范围
本文件规定了上海地区医学实验室临床微生物检验质量管理基本内容和要求。
2 规范性引用文件
3 术语和定义
4 管理要求
4.1 组织和管理责任
4.2 质量管理体系
4.3 文件控制
4.4 服务协议
4.5 受委托实验室的检验
4.6 外部服务和供应
4.7 咨询服务
4.8 投诉的解决
4.9 不符合的识别和控制
4.10 纠正措施
4.11 预防措施
4.12 持续改进
4.13 记录控制
4.14 评估和审核
4.15 管理评审
4.16 应急预案和补救措施
5 实验室技术要求
5.1 人员
5.1.2 人员资质
临床微生物学实验室（以下简称“实验室”）负责人至少应具有以下资格：中级技术职称；医学、医学检验专业背景，或相关专业背景经过医学检验培训；3年临床微生物工作经验。
报告审核人员应具有中级及以上专业技术职称，从事本专业工作至少3年。在本实验室固定设施以外场所，如在临时实验室、移动实验室、抽样现场或野外现场进行检测和抽取样品，都必须在适当的技术控制和有效监督下进行。需要时，可在提供检测结果的上述场所设报告审核人，且应保留其所有相应活动的记录。
a）实验室应设置生物安全责任人和生物安全监督员，负责生物安全；
b）有颜色视觉障碍者不应从事涉及辨色的微生物学检验；
c）实验室人员应熟悉生物检测安全操作知识和消毒灭菌知识；
d）实验室使用的高压蒸汽灭菌器，操作人员需持有特种作业人员证书。
5.1.5 培训
应每年对各级工作人员制定培训计划并进行微生物专业技术及知识、质量保证等培训。实验室应制定人员培训和继续教育计划，包括常规微生物检测、无菌操作、生物防护、生物安全柜维护等方面知识的专门培训，掌握相关的知识和专业技能。
5.1.6 能力评估
应每年评估员工的工作能力。实验室可通过内部质量控制、能力验证或使用实验室间比对等方式评估检测人员的能力和确认其资格。对新进员工，在最初6个月内应至少进行2次能力评估。新上岗人员以及间隔一定时间重新上岗的人员需要重新评估。
当职责变更时，或离岗6个月以上再上岗时，或政策、程序、技术有变更时，应对员工进行再培训和再评估，合格后才可继续上岗，并记录。
5.2 设施和环境条件
5.2.1 总则
实验室的建设、总体布局和设施应能满足从事检验工作的需要，并以能获得可靠的检测结果为重要依据，且符合所开展微生物检测活动生物安全等级的要求。对影响检测结果或涉及生物安全的设施和环境条件的技术要求应制定成文件。实验室内照明宜充足，避免阳光直射及反射，如可能，可在实验室内不同区域设置照明控制，以满足不同实验的需要。应有可靠的电力供应和应急照明。
a）对需要在洁净条件下工作的区域，实验室应能有效地监控和记录环境条件，当条件不满足检测方法要求或者可能影响到检测的结果时，应停止检测；
b）对需要使用的无菌器具和器皿应能正确实施灭菌；无菌器具和器皿应有明显标识以与非无菌器具和器皿加以区别；
c）应定期使用生物指示物检查灭菌设备的效果并记录，指示物应放在不易达到灭菌的部位。日常监控可以采用物理或化学方式进行。
5.2.2 实验室和办公设施
实验室总体布局应减少和避免潜在的污染和生物危害，即实验室布局设计宜遵循“单方向工作流程”原则，防止潜在的交叉污染。
a）办公室应与实验室有效隔离。实验室间应有有效的隔离，有措施防止交叉污染；
b）实验室与休息、办公区应有相应的物理隔断，确保实验室和休息、办公区不能有交叉污染；
c）实验室应配备满足要求的生物安全柜；
d）使用时，应限定在某个工作区域专门使用的物品如防护服、移液器、离心管等；
e）检测样品中的霉菌时，要有适当的措施控制孢子在空气中的扩散。
不同的功能区域应有清楚的标识。实验室应正确使用与检测活动生物安全等级相对应的生物危害标识。实验室应对授权进入的人员采取严格控制，并明确以下内容：
a）特殊区域的特定用途；
b）特殊工作区域的限制措施；
c）采取这些限制措施的原因。
5.2.5 患者样品采集设施
患者样品采集设施应将接待/等候和采集区分隔开。同时，实验室的样品采集设施也应满足国家法律法规或者医院伦理委员会对患者隐私保护的要求。
5.2.6 设施维护和环境条件
应依据所用分析设备和实验过程的要求，制定环境温湿度控制要求并记录。应有温湿度失控时的处理措施并记录。
必要时，实验室可配置不间断电源（UPS）和（或）双路电源以保证关键设备（如需要控制温度和连续监测的分析仪、培养箱、冰箱等）的正常工作。
5.2.7 实验室生物安全管理
凡是实验操作卫生部文件《人间传染的病原微生物名录》内规定的生物危害第三、四类的致病微生物或少量第二类致病微生物（仅为样品检测）的临床实验室为二级病原微生物实验室（BSL-2），其实验室所用设施、设备和材料、生物安全管理和实验操作均应符合《实验室生物安全通用要求》和《病原微生物实验室生物安全通用准则》中关于二级生物安全实验室的相关标准和要求。
进入实验室要穿工作服，不允许穿着工作服到实验室以外的地方。
微生物实验室应列明可能存在的危险因子的清单，以便在意外事故发生后能将详细信息及时提供给医生。
实验室应有妥善处理废弃样品和废弃物（包括废弃培养物）的设施和制度。
实验室应制定临床微生物实验室内生物安全事故的处理程序。
生物安全事故（包括生物危险物质溢洒）要立即进行处置，并评价是否对人员、环境、设施和客户等造成危害，是否对检测结果和客户造成影响。
5.3 实验室设备、试剂和耗材
5.3.1 设备
5.3.1.1 总则
实验室设备配置 实验室应配备满足检测工作要求的仪器设备，如生物安全柜、培养箱、水浴锅、冰箱、均质器、显微镜等。其中，生物安全柜的类型和安装应满足工作要求；培养箱的数量和种类（如特殊温度范围和气体要求）、冰箱应满足诊断需要；无菌体液的显微镜检查应配备细胞离心机。临床微生物实验室根据实验需要配备包括必要通用基础设备和专用基本检测设备。
临床微生物实验室根据实验需要配备必要通用基础设备：
a）普通孵育箱（28℃、35℃至少各1台）；
b）冰箱（4℃）；
c）二氧化碳孵育箱（35℃）；
d）离心机（做结核分枝杆菌检验的离心机转子应该带有防气溶胶的密封盖）；
e）高压蒸汽灭菌锅；
f）Ⅱ级（含二级）以上生物安全柜；
g）个人防护材料如隔离衣，防护口罩帽子等；
h）样品转运箱（符合生物安全要求，带扣防渗漏，箱内有样品支架）。
临床微生物实验室根据实验需要配备专用基本检测设备：
a）细菌/药敏鉴定系统（半自动或全自动鉴定/药敏仪，也可使用手工的鉴定系统）；
b）血培养仪（也可使用人工判读的血培养瓶）；
c）厌氧培养系统［如开展此项目（包括开展厌氧血培养）；厌氧培养系统包括厌氧手套箱或厌氧抽气换气系统或厌氧罐/袋，厌氧袋为一次性使用］；
d）光学显微镜（物镜要配备低倍、高倍、油镜）。
5.3.1.3 设备使用说明
设备应由经过授权的人员操作。设备使用和维护的最新版说明书（包括设备制造商提供的有关手册）应便于合适的实验室有关人员取用。
5.3.1.4 设备校准和计量学溯源
实验室应配备正确进行检测和（或）校准（包括抽样、物品制备、数据处理与分析）所要求的所有抽样、测量和检测设备。当实验室需要使用永久控制之外的设备时，应确保满足本规范（如性能验证、比对实验等，并有记录）。
设备校准要求：用于检测、校准和抽样的设备及其软件应达到要求的准确度，并符合检测和（或）校准相应的规范要求。对结果有重要影响的仪器的关键量或值，应制定校准计划。设备（包括用于抽样的设备）在投入服务前应进行校准或核查，以证实其能够满足实验室的规范要求和相应的标准规范。设备在使用前应进行核查和（或）校准。
a）自动化鉴定仪、血培养仪的校准应满足制造商建议；
b）每6个月进行检定或校准的设备至少应包括浊度仪；
c）每12个月进行检定或校准的设备至少应包括：生物安全柜（高效过滤器、气流、负压等参数）、CO2浓度检测仪、细胞离心机、压力灭菌器、游标卡尺、培养箱、温度计、移液器、微量滴定管或自动分配器；
d）应保存仪器功能监测记录的设备至少应包括：温度依赖设施（冰箱、培养箱、水浴箱、加热块等每日记录温度）、CO2培养箱（每日记录CO2浓度）、超净工作台（定期做无菌试验）、压力灭菌器（至少每个灭菌包外贴化学指示胶带、内置化学指示卡，定期进行生物监测）。
5.3.1.5 设备维护与维修
实验室应具有安全处置、运输、存放、使用和有计划维护测量设备的程序，以确保其功能正常并防止污染或性能退化。检测和校准设备包括硬件和软件应得到保护，以避免发生致使检测和（或）校准结果失效的调整。
注：在实验室固定场所外使用测量设备进行检测、校准或抽样时，可能需要附加的程序。
应制定预防性维护计划并记录的设备至少应包括：生物安全柜、CO2培养箱、自动化鉴定仪、血培养仪、压力灭菌器、超净工作台、显微镜和离心机。
如果设备故障影响了方法学性能，在设备修复、校准后，实验室可通过检测质控菌株或已知结果的样品方式进行性能验证。无论什么原因，若设备脱离了实验室的直接控制，实验室应确保该设备返回后，在使用前对其功能和校准状态进行核查并能显示满意结果。
当需要利用期间核查以保持设备校准状态的可信度时，应按照规定的程序进行。当校准产生了一组修正因子时，实验室应有程序确保其所有备份（例如计算机软件中的备份）得到正确更新和正确使用。
5.3.1.6 设备不良事件报告
曾经过载或处置不当、给出可疑结果，或已显示出缺陷、超出规定限度的设备，均应停止使用。这些设备应予隔离以防误用，或加贴标签、标记以清晰表明该设备已停用，直至修复并通过校准或检测表明能正常工作为止。实验室应核查这些缺陷或偏离规定极限对先前的检测和（或）校准的影响，并执行“不符合工作控制”程序。
5.3.1.7 设备记录
用于检测和校准并对结果有影响的每一设备及其软件，如可能，均应加以唯一性标识。实验室控制下的需校准的所有设备，只要可行，应使用标签、编码或其他标识表明其校准状态，包括上次校准的日期、再校准或失效日期。
应保存对检测和（或）校准具有重要影响的每一设备及其软件的记录。该记录至少应包括：
a）设备及其软件的识别；
b）制造商名称、型式标识、系列号或其他唯一性标识；
c）对设备是否符合规范的核查；
d）当前的位置（如果适用）；
e）制造商的说明书（如果有），或指明其存放地点；
f）所有校准报告和证书的日期、结果及复印件，设备调整、验收准则和下次校准预定日期；
g）设备维护计划，以及已进行的维护（适当时）；
h）设备的任何损坏、故障、改装或修理。
5.3.2 试剂和耗材
5.3.2.3 试剂和耗材的验收试验
实验室应建立和保持有效的适合试验范围的培养基（试剂）验收程序。该程序包括对即用型培养基、商品化脱水合成培养基（包括完全培养基和需添加补充物的基础培养基）进行评估的方式和储存的规定、拒收的标准等。实验室应保留生产厂商提供的培养基质量测试报告。要求厂商在培养基任何配方改变时应及时告知实验室。
对于关键培养基和试剂，要求进行技术性验收，可参考ISO/TS 11133或SN/T 1538《培养基制备指南》。当有足够数据证明其可信性时，验收的技术性指标可以减少。实验室不得使用不符合要求的培养基和试剂。实验室应有关键培养基（试剂）的批号、入库日期、开启日期等的记录。
针对即用型培养基、商品化脱水合成培养基，除对每批培养基用标准菌株进行测试验收外，适用时，可用人工污染实际样品进行检测，以更好地验证培养基的适用性；含有指示剂或选择剂的培养基，应使用能证明其指示或选择作用的菌株进行试验。
a）新批号及每一货次试剂和耗材使用前，应通过直接分析参考物质、新旧批号平行实验或常规质控等方法进行验证，并记录；
b）新批号及每一货次试剂和耗材，如吲哚试剂，杆菌肽，奥普托辛，X、V、XV因子纸片等应使用阴性和阳性质控物进行验证；
c）新批号及每一货次的药敏试验纸片使用前应以标准菌株进行验证；
d）新批号及每一货次的染色剂（革兰染色、特殊染色和荧光染色）应用已知阳性和阴性（适用时）的质控菌株进行验证；(https://www.daowen.com)
e）新批号及每一货次直接抗原检测试剂（无论是否含内质控）应用阴性和阳性外质控进行验证；
f）培养基外观良好（平滑、水分适宜、无污染、适当的颜色和厚度，试管培养基湿度适宜），新批号及每一货次的商品或自配培养基应检测相应的性能，包括无菌试验、生长试验或与旧批号平行试验、生长抑制试验（适用时）、生化反应（适用时）等，应以质控菌株进行验证；
g）一次性定量接种环每批次应抽样验证。
5.3.2.7 试剂和耗材的记录
对实验室自制的培养基即实验室制备个别成分培养基，实验室应有培养基质量控制程序。应有在培养基的配制过程中避免接触性和吸入性危害的措施。质量控制程序包括培养基的性能测试、实验室内部的配制规范等，以监控基础材料的质量，目的是保证培养基验收合格，确保不同时期制备的培养基性能的一致性和符合检测的要求。各种培养基（试剂）的制备过程应有记录，内容至少应包括：
a）培养基（试剂）名称和类型；
b）配制日期和配制人员；
c）培养基（试剂）的体积；
d）分装体积；
e）成分及其含量、制造商、批号；
f）最初和最终p H（适用时）；
g）无菌措施，包括实施的方式、时间和温度（适用时）。
菌株管理记录：
实验室必须保存有满足试验需要的标准菌种/菌株（标准培养物），除检测方法（如药物敏感试验、抗菌性能测试）中规定的菌种外，还应包括应用于培养基（试剂）验收/质量控制、方法确认/证实、阳性对照、阴性对照、人员培训考核和结果质量的保证等所需的菌株。实验室应有程序和措施以保证标准菌种/菌株的安全，防止污染、丢失或损坏，确保其完整性。
标准菌株管理记录：标准菌种必须从认可的菌种或标本收集途径获得。实验室应有文件化的程序管理标准菌种（原始标准菌种、标准储备菌株和工作菌株），涵盖菌种申购、保管、领用、使用、传代、存储等诸方面，确保溯源性和稳定性。该程序应包括：
a）保存菌株应制备成储备菌株和工作菌株。标准储备菌株应在规定的时间转种传代，并做确认试验，包括存活性、纯度、实验室中所需要的关键特征指标，实验室必须加以记录并予以保存；
b）每一支标准菌种都应以适当的标签、标记或其他标识方式来表示其名称、菌种号、接种日期和所传代数；
c）记录中还应包括（但不限于）以下内容：从原始菌种传代到工作用菌种的代数；菌种生长的培养基及孵育条件；菌种生存条件。
所有的标准菌种从原始标准菌种到储备菌株和工作菌株传代培养次数原则上不得超过5次，除非标准方法中有明确要求，或实验室能够证明其相关特性没有改变。
样品菌株管理记录：取样应由经过培训合格的人员进行。对于有完整包装的样品，尽可能整件抽取，减少操作过程，避免污染。对于无完整包装或需要打开包装抽取的样品，要求无菌取样，监控并记录需要控制的因素包括相关的环境条件（如采样时间、采样点的环境状况等）。
运输和储存应在一定的条件下（如合适的冷藏或冰冻），以保持样品的完整。监测条件并保存记录。如果条件合适，应有从取样到送达检测实验室的运输和储存的详细的责任档案。样品的检测要尽可能在取样之后及时进行，并且要符合相关标准。
建立样品的标识系统，确保样品在传递过程中不会对测试结果造成影响，不会混淆和误用，保护样品的完整性及实验室与客户的利益。样品标识系统中应包括样品检测过程中涉及的增菌液和培养皿等的标识规定，确保在容器上和培养皿上等的标记要安全可见并可追溯。
样品储存和运输过程中诸如温度、持续时间等因素对微生物定量检测的结果会有影响，实验室应核查并记录所接受样品的状态。
a）样品贮存设备应足够保存所有的试验样本，并具备保持样本完整性和不会改变其性状的条件。在试验样本需要低温保存时，冷冻冷藏设备必须有足够的容量和满足样本保存所要求的条件。
b）致病菌检测项目的结果报告发出后，方能处理剩余的微生物样品，并满足实验室对样品保存的规定要求。检出致病菌的样品以及疑似病原微生物污染的样品应经过无害化处理。
5.4 检验前过程
5.4.3 申请单信息
检验申请单应包括临床诊断，必要时说明感染类型和（或）目标微生物，宜提供抗菌药物使用信息。
5.4.4 原始样品采集和处理
5.4.4.2 采集前活动的指导
样品的收集、运输、储存、处理、销毁等按照上海市病原微生物菌（毒）种或样品运输及保存规范的相关规定。
收到样品后记录验收时间和接种时间，原则上应在2小时内作相应处理，暂时不能处理的应按规定贮存。
5.4.4.3 采集活动的指导
不同部位样品的采集方法。如：明确说明并执行血培养样品采集的消毒技术、合适的样品量。诊断成人不明原因发热、血流细菌感染时宜在不同部位抽血2套，每套2瓶（需氧、厌氧各一瓶）；儿童患者至少做一套血培养（推荐做两套血培养）；所有用于厌氧培养的样品，应根据样品的不同性状，置适宜的厌氧培养专用运送培养基内（包括厌氧血培养瓶），方可尽快送检。实验室应组织厌氧培养样品采集的专门培训，确保样品采集或置入厌氧培养专用运送培养基时，不得破坏运送培养基（包括厌氧血培养瓶）的厌氧环境，并有培训及考核记录。痰样品直接显微镜检查找抗酸杆菌或结核分枝杆菌培养，应送检三份痰样品；最好至少连续3日，采集每日清晨第一口痰。
5.4.5 样品运送
明确规定需要尽快运送的样品，延迟运送时，有样品适宜的保存方法。采用合适的运送培养基；采用安全运送样品的方法（如密封容器、无样品外漏等）。
5.4.6 样品接收
应制定样品接收标准，如无肉眼可见的渗漏、合适的样品类型/量、正确的保存、预防拭子干燥的措施、适当的运送培养基等；宜评估样品的质量并反馈评估结果（如血培养标本的血量、套数、污染率等），痰标本检验前需做痰的质量检查。不合格的样品（如痰样品等）宜尽快通知医生、护士或患者（门诊），以便重新采集。
5.5 检验过程
5.5.1 检验程序的选择、验证和确认
5.5.1.2 检验程序验证
新的鉴定系统使用前，应查阅已发表的完整、科学的系统评估文献作为性能验证的初级证据，再按优先顺序依次选择标准菌株、质控菌株或其他已知菌株对商业鉴定系统（包括自动、半自动、手工）每种板（条/卡/管）的鉴定/药敏结果的符合性进行验证。在进行方法证实时，样品的选择最好采用自然污染样品或人为添加目标微生物的样品进行方法证实试验。当有几种方法可供选择，或标准化方法提供多种可选程序时，实验室应有相应选择规定。
微生物鉴定系统的验证：在微生物鉴定系统常规应用前，实验室应对检验系统进行独立验证。验证的性能指标，应与检验结果的预期用途相关。
a）需要进行确认与验证的微生物鉴定系统，包括传统生化鉴定系统、质谱鉴定系统、分子生物学鉴定系统（或其衍生方法）等；
b）菌株按优先顺序，依次选择标准菌株、质控菌株或其他已知菌株，试验应覆盖实验室使用的全部卡片种类和（或）方法；
c）菌株种类选择范围应参照厂商说明书，覆盖革兰阳性和革兰阴性非苛养菌、苛养菌、厌氧菌、念珠菌、隐球菌等，每种类型应至少1株，总体不少于20株；
d）一般要求鉴定至“种”水平，特殊微生物（如棒状杆菌、厌氧菌，芽孢杆菌）可鉴定到“属”；
e）标准/质控菌株符合率应为100%，临床菌株的符合率应在90%以上。
5.5.1.3 检验程序的确认
微生物检验非标方法的确认，可以参照AS/NZS 4659、AOAC INTERNATIONAL Methods Committee Guidelines for Validation of Qualitative and Quantitative Food Microbiological Official Methods of Analysis、ISO 16140或SN/T 3266—2012。
5.5.1.4 被测量值的测量不确定度
适用时，检验程序验证内容宜包括精密度、线性、准确度、分析灵敏度、分析特异度、生物参考区间。通常，培养方法的性能特征不包括精密度和线性。
在微生物检测领域，某些情况下，一些检测无法从计量学和统计学角度对测量不确定度进行有效而严格的评估，这时至少应通过分析方法，考虑它们对于检测结果的重要性，列出各主要的不确定度分量，并作出合理的评估（必要时）。有时在重复性和再现性数据的基础上估算不确定度也是合适的。
5.5.3 检验程序文件化
细菌培养和鉴定程序应满足如下要求：操作规程编写应按照WS/T 227—2002《临床检验操作规程编写要求》等相关要求，此外还应包括（不限于）下列内容：
a）样品的采集、运送、接收、处理以及样品拒收标准；
b）血培养、脑脊液的分级报告；
c）检验流程：细菌的分离培养操作说明（包括对病原菌菌落的具体描述），包括流程图、注意事项；
d）脑脊液培养，必须包含增菌过程；无菌体液培养，应按照《全国临床检验操作规程》（最新版）的具体要求执行；
e）细菌鉴定；
f）结果报告；
g）药敏试验方法、结果判断标准、质控方法、质控范围；
h）临床意义。
所选择的涂片、染色技术、培养基应能从样品中分离、识别相应的病原菌；鉴定方法应符合要求，如通过血清学、革兰染色、菌落形态、生长条件、代谢反应、生化和酶活性、抗菌药物耐药性谱等特性鉴定；应有处理组织样品的能力。
应明确伤口样品培养程序，深部伤口感染应至少包括样品采集、需氧菌及厌氧菌的培养及鉴定。如果不具备厌氧培养条件，则应将样品置合格的厌氧运送系统迅速送有条件的实验室。应有适当的检测苛养菌（如放线菌，快速生长的分枝杆菌等）的方法。
厌氧菌培养时间与样品类型、诊断有关，在第一次培养评估之前应有足够的培养时间（至少48小时）。应有合适的液体培养基及适当的鉴定方法（适用时）。
分枝杆菌样品应置密闭的防渗漏容器内；某些样品（如：尿液、脑脊液）抗酸染色应浓缩，所有样品培养前应浓缩。应以密闭试管置密封离心架内离心，还应满足下列要求：
a）按照上海市结核病防治工作的质量要求开展结核病检验工作；
b）新的载玻片应经过95%乙醇脱脂，检查无痕后使用；
c）每张玻片只限涂一份样品，严禁重复使用；
d）抗酸染色每周开展阳性/阴性质控；
e）自制抗酸染色第一液应定期过滤清除染料沉渣；
f）抗酸染色镜检结果采用分级报告，阳性结果应由他人复验，阴性结果可根据实际样本量进行抽查（10%～20%）；
g）所有抗酸染色镜检片上的唯一性编号应与登记一致，至少保留3个月，定期抽查并记录。
真菌培养宜使用含和不含抗菌药物的两类培养基。经空气传播有高度感染性的真菌样品、含菌丝体的真菌应在生物安全柜内处理。若采用平皿培养，应封盖。
病毒培养时，应详细记录细胞类型、传代数、细胞来源、培养基及生长状况；应检测并记录培养基和稀释剂的无菌试验和p H；应监测细胞病变效应，以优化培养的最佳时间。应比较未经接种或接种无菌物质的单层细胞与接种临床样品的培养物。
法定传染病病原微生物的检验程序应满足如下要求：
a）检验程序应至少符合国家标准或卫生行业标准；
b）当培养过程中发现人间传染的高致病性病原微生物（依据《人间传染的病 原微生物名录》）时，应按相关法规要求进行处理，或送至相应级别的生物安全实验室进行检验。
常规细菌培养和鉴定程序，实验操作还应满足下列要求：
a）所有产生气溶胶的操作应在生物安全柜内进行，生物安全柜内避免使用明火；
b）标本作细菌分离培养时，一块平板只限接种一份标本，初次分离用非选择性培养基的平板，直径应不小于9 cm；
c）中段尿细菌培养时必须定量接种并作菌落计数，推荐使用移液器定量接种；
d）下呼吸道标本做细菌培养时要求同时接种血平板、麦康凯平板（或其他弱选择性平板）、巧克力平板；
e）应包括适宜的培养环境和足够的培养时间；用于苛氧菌分离培养的平板接种后必须放入5%～10%二氧化碳环境；
f）应有适当的方法和能力检测苛养菌（如肺炎链球菌、A群链球菌、脑膜炎奈瑟菌、淋病奈瑟菌、流感嗜血杆菌、放线菌等），有临床需求的可开展厌氧菌检验。
细菌抗菌药物敏感性试验程序应满足如下要求：
a）应制定常规药敏试验方法（纸片扩散法、琼脂稀释法、微量肉汤稀释法、E试验或其他）的操作程序（含各类病原体和/或样品的检测药物、质控标准、结果解释等）；
b）抗菌药物敏感性试验方法包括纸片扩散法、稀释法（琼脂稀释法、肉汤稀释法）、浓度梯度扩散法（E试验）或自动化仪器检测；实验室应提供与服务相适应的抗菌药物敏感性试验。
细菌培养和鉴定原始记录：
a）每一份标本均要有检验过程的原始记录，原始记录至少应包括以下信息：病人信息、样品类型、样品接收和接种时间、接种的培养基、孵育条件和时间、病原菌的涂片和菌落形态、初步的生化试验结果、病原菌鉴定的器材、药敏试验结果、检验人员等；
b）原始记录应信息完整、字迹清晰可辨，无涂改。如需修正应采用杠改法。
5.6 检验结果质量保证
5.6.1 总则
实验室应制订质量控制计划，对内部质量控制活动的实施内容、方式、责任人作出明确的规定；对内部质量控制活动，计划中还应给出结果评价依据。质量控制计划应尽可能覆盖实验室的所有检测项目和所有检测人员。实验室应根据工作量、人员水平、能力验证结果、外部评审等情况对质控频次做出明确规定，如：定量检测项目6次/年，定性检测项目4次/年等。在实施人员比对、设备比对和方法比对时，要选取均匀性和稳定性符合要求的样品进行。
5.6.2 室内质量控制
5.6.2.1 总则
细菌培养与鉴定试剂、耗材室内质量控制应满足如下要求：
a）使用中的染色剂（革兰染色、特殊染色和荧光染色），至少每周用已知阳性和阴性（适用时）的质控菌株检测；自配的染色液，应将整个配制过程的操作步骤形成记录并保存；商品化染色液：应向生产商索取染色液鉴定的质量保证书；染色液应每周做一次质量控制（若检测频率小于每周1次，则实验当日做一次质量控制）；
b）凝固酶、过氧化氢酶、氧化酶、β-内酰胺酶，实验当日应做阴性和阳性质控，Optochin纸片、杆菌肽、商业头孢菌素试剂的β-内酰胺酶试验可遵循制造商的建议，每周做一次阴性和阳性质量控制。诊断性抗血清试剂，实验当日至少应做多价血清阴性和阳性质控。定性试验试剂每次检测时应至少包括阳性和阴性质控菌株。直接抗原检测试剂，若含内质控，每一新批号需检测阳性和阴性外质控并记录。不含内质控的直接抗原检测试剂，实验当日应检测阳性和阴性质控并记录；所有试剂要有名称、浓度或滴度、存放条件、配制时间、失效期。若试剂启封，改变了有效期和储存条件，宜记录新的有效期。试剂的储存条件宜遵循生产商的建议，并在标明的有效期内使用；
c）非培养检测项目（如细菌性阴道病唾液酸酶测定、支原体检查、衣原体检查、真菌D-葡聚糖检测、呼吸道九联检等）的检测试验，其室内质量控制需有阴、阳性对照的质控；
d）厌氧菌：应以有效的方法检测厌氧培养环境（如以亚甲蓝试条、厌氧菌或其他适当方法）；
e）分枝杆菌：抗酸染色应在实验当日用适当的阴性和阳性质控验证；荧光染色应每次实验以阴性和阳性质控验证；
f）真菌：直接染色（如抗酸染色、PAS、吉姆萨染色、墨汁染色）检查患者样品时，应在实验当日做阴性和阳性质控（某些染色如吉姆萨染色，玻片本身作为阴性质控；KOH制备的玻片不需要质控）；
g）病毒：连续细胞传代时应定期监测支原体污染（宜监测阴性未传代的质控株，而不是培养支原体）；应监测用于细胞生长培养液的动物血清的细胞毒性；应具备相应的细胞株用于病毒培养。
药敏试验室内质控应满足如下要求：
实验室采用的抗菌药物敏感性试验方法应以质控标准菌株连续检测20～30天，每一组药物/细菌超出参考折点（抑菌圈直径或MIC）的频率应不超过（≤）1/20或3/30；也可采用替代质控方案，即连续5天，每天对每一组药物/细菌重复测定3次，每次单独制备接种物，15个数据超出参考折点（抑菌圈直径或MIC）的结果应不超过（≤）1个，若失控结果为2～3个，则如前述，再进行5天，每天3次重复试验，30个数据失控结果应不超过（≤）3个。此后，应每周使用标准菌株进行质控。若检测频率小于每周1次，则每个检测日应进行质控。采用自动或半自动仪器检测MIC时，药敏试验质控每月1次。
质谱鉴定系统的室内质控应满足下列要求：
实验室应使用与质谱鉴定系统响应、尽可能接近临床待测菌株的质控物，按优先顺序，依次为标准菌株、质控菌株或其他已知菌株，应覆盖质谱鉴定系统所涉及的全部菌株种类，包括革兰阳性和革兰阴性非苛养菌、苛养菌、厌氧菌、念珠菌、隐球菌等五种（实验室鉴定菌株未涉及的种类可除外），每种类型应至少1株，总体不少于5株。用质谱技术鉴定丝状真菌的实验室，质控菌株还应包括丝状真菌。每个工作日至少使用BTS标准液在靶板点样1次；每月至少使用质控菌株做质控1次。实验室应保留每次质控菌株的鉴定图谱和原始记录。
分子生物学鉴定系统（或其衍生方法）的室内质量控制，参见《附录E临床分子生物学检验领域质量管理要求》5.6.2室内质量控制相关条款。
5.6.2.2 质控物
实验室应贮存与诊断相配套的质控物，以便在染色、试剂、试验、鉴定系统和抗菌药物敏感性试验中使用。药敏用标准菌株种类和数量应满足工作要求，保存其来源、传代等记录，并有证据表明标准菌株性能满足要求。
5.6.3 实验室间比对
5.6.3.1 参加实验室间比对
实验室应按照质量管理要求，参加与检验项目相应的能力验证/室间质评。应能提供参加能力验证/室间质评的结果和证书。实验室负责人或指定人员应监控能力验证/室间质评活动的结果，并在结果报告上签字。发现失控应立即查找原因，采取纠正措施并记录。有相应能力验证/室间质评的质控项目的实验室，必须参加；无能力验证/室间质评的项目，实验室可以选择替代程序，如与同级或更高级别实验室进行该项目的比对实验。
5.6.4 检验结果的可比性
实验室用两套及以上检测系统（仪器/试剂）检测同一项目时，应有比对数据表明其检测结果的一致性。相同的定性检验项目在不同的检测系统上进行检测时，每年至少做一次比对实验；相同的定量检测项目在不同的检测系统上检测，每6个月至少做一批样品比对实验。实验室应保存比对实验的原始记录。
a）细菌鉴定项目，应选择至少5份个样本，覆盖革兰阳性和革兰阴性非苛养菌、苛养菌、念珠菌、隐球菌、厌氧菌（如开展厌氧菌鉴定项目）等，标准菌株符合率应为100%，临床菌株的符合率应在90%以上；
b）细菌性阴道病唾液酸酶（BV）项目，应选择至少5份个样本（包含高、中、低浓度和阴性），检测结果应80%符合；
c）真菌β-D-葡聚糖、内毒素检测等定量检测项目，应选择至少5个样品，其浓度均匀分布在试剂盒或检验程序的测量区间，计算偏倚%，应＜1/2TEa；
d）针对微生物定量检测项目，应定期使用有证标准物质/标准样品进行监控，或使用质控样品开展内部质量控制活动。针对微生物定性检测项目，应定期使用标准物质/标准样品、质控样品或用标准菌种人工污染的样品开展内部质量控制。
应制定人员比对的程序，规定由多个人员进行的手工检验项目比对的方法和判断标准，至少包括显微镜检查、培养结果判读、抑菌圈测量、结果报告，定期（至少每6个月1次，每次至少5份临床样品）进行检验人员的能力比对、考核并记录。
5.7 检验后过程
实验器材和废弃物处置应由专人负责。实验室污水、污物（如实验用一次性个人防护用品和实验器材）、弃置的菌（毒）种、生物样品、培养物和被污染的废弃物应在实验室内无害化处理后，达到生物学安全后再按感染性废弃物收集处理。
5.8 结果报告
5.8.1 总则
结果报告应与检验的内容一致，如粪便沙门菌、志贺菌培养，报告为“未检沙门菌、志贺菌”。血培养阴性结果报告应注明培养时间。普通血培养5天无细菌生长可报告：“5天培养未见细菌生长”，但培养瓶要继续培养至7天。如果发现有细菌生长，可发补充报告，某些特殊病原菌培养时间需延长。
血液、脑脊液、国家规定需立即上报的法定细菌性传染病的显微镜检查及培养阳性结果应立即报告临床；应在收到样品24小时内报告分枝杆菌抗酸或荧光染色结果。
5.8.3 报告内容
药物敏感试验报告基本信息：
a）报告单包括信息：患者信息（姓名、年龄、性别、病历号等）、临床信息（如科室、临床诊断、标本类型等）、实验室信息（包括标本采集时间、送检时间、接收时间和审核报告时间、操作人和审核人双签名）等；
b）涂片、培养鉴定和药敏试验同时出现在报告单上时，建议先写涂片、培养鉴定结果，按原始标本涂片——培养鉴定结果——药敏试验的顺序呈现，应注意结果的准确性和完整性；
c）细菌名称应规范化，药物名称应使用规范的化学通用名称，禁止使用商品名。建议在检验报告中，同一类药物不同品种集中排列。
药物敏感试验报告结果方式：
a）按照“抗菌药物”“折点”“MIC/KB”“结果解释”顺序排列报告内容；
b）如果适用，报告单应明确列出各类药物对待测菌种的药敏判定标准，即“折点”。不宜使用“参考值”“参考范围”等替代“折点”；
c）报告单应明确列出各类药物对待测菌种的药敏试验结果，即“结果解释”。不宜用“敏感度”替代“结果解释”；
d）如果适用，可根据折点将结果解释分为“敏感”“中介”“耐药”或“剂量依赖敏感”，也可使用“S”“I”“R”“SDD”表示，但两种表示方法不宜同时使用或混用；
e）MIC法，须报告MIC数值和结果解释，MIC的单位为μg/ml，或mg/L；
f）纸片扩散法，须报告抑菌圈直径和结果解释，抑菌圈直径数值为整数，单位为mm；
g）替代药物不能直接报告“敏感”或“耐药”，可以报告阳性或阴性；天然耐药的抗菌药物不得报告；
h）少见和矛盾耐药表型需要进行确认，并建议在报告中明确标注特殊耐药表型，如MRSA、CRE、VRE等；
i）检出具有重要临床意义或传染病学意义的病原菌，要及时提示临床，如“高致病性/高传播性病原菌”“需要上报传染病卡”等。
5.9 结果发布
5.9.4 危急值报告
血液、脑脊液样品的涂片、培养为阳性鉴定结果时，应作为危急值立即电话通知/发送分级报告至临床医师（如样品直接涂片或湿片直接镜检、培养结果的判读等阳性发现），并按照危急值的处理程序与要求，准确记录仪器报告培养阳性的时间和危急值报告时间（准确至____时____分），并有确认临床收到危急值报告的有效方法。其他无菌部位来源样品，宜按照实验室规定时间报告直接涂片镜检的阳性结果。
当同一个血培养、脑脊液培养分级报告的结果不一致时，应进行原因分析，将未报告培养阳性的培养瓶转种平板进行培养结果核实，必要时与临床沟通或反馈，并记录。
应保存抗菌药物敏感性试验资料，定期向临床医师报告流行病学分析结果。
5.10 实验室信息管理