附录E（规范性附录） 分子诊断领域质量管理要求
1 范围
本文件规定了分子诊断领域质量管理专项要求，包括：病原体核酸和人体基因等领域涉及的核酸扩增试验、杂交试验（包括原位杂交试验）、核酸电泳分析等。
2 规范性引用文件
3 术语和定义
4 管理要求
4.1 组织和管理责任
4.1.1 组织
4.1.1.2 法律实体
实验室为独立法人单位的，应有医疗机构执业许可，执业证书的诊疗科目中应有医学检验科—临床细胞分子遗传学专业；实验室为非独立法人单位的，其所属医疗机构执业证书的诊疗科目中应有医学检验科或病理科等。临床实验室开展临床基因扩增检验技术和基因芯片诊断技术需经上海市临床检验中心技术评估合格并向核发《医疗机构执业许可证》的卫生行政部门备案后方可开展。临床基因扩增检验实验室的设置应为二级及以上医疗机构或具备相应临床应用能力和条件的医疗机构及医学检验所。医疗机构对临床基因扩增检验实验室应当集中设置，统一管理。
临床实验室应根据其核定的分子诊断技术评估项目开展工作。如需要增加分子诊断项目，应向上海市临床检验中心提出新技术评估申请，并向核发《医疗机构执业许可证》的卫生行政部门备案后方可开展。
临床实验室如开展自建分子诊断项目应按国家相关规定执行，其实验室资质、人员要求、管理要求及质量控制要求应符合相关规定。
以科研为目的的检测项目，不得向临床出具检验报告，不得向病人收取任何费用。
4.2 质量管理体系
4.2.1 总则
临床实验室开展分子诊断技术应按照相关要求建立质量管理体系。
开展孕妇外周血胎儿游离DNA产前筛查与诊断的实验室应按照《孕妇外周血胎儿游离DNA产前筛查与诊断实验室检测技术规范》相关要求建立检出率、假阳性率、阳性预测值、检测失败率等相关质量控制指标。
4.3 文件控制
4.4 服务协议
4.5 受委托实验室的检验
4.6 外部服务和供应
4.7 咨询服务
4.8 投诉的解决
4.9 不符合的识别和控制
4.10 纠正措施
4.11 预防措施
4.12 持续改进
4.13 记录控制
所有检测的原始记录和导出数据均应包括足够的信息以保证其能够再现。
标本检测过程中，应及时、准确、如实记录，包括操作人员、仪器、试剂及原始数据、计算和（或）导出数据、质控信息等。
分子遗传、分子病理、产前筛查与诊断等相关记录的保存期限按相关要求执行。
4.14 评估和审核
4.15 管理评审
4.16 应急预案和补救措施
5 实验室技术要求
5.1 人员
5.1.2 人员资质
分子诊断实验室（以下简称实验室）负责人应至少具有中级专业技术职称、医学检验或相关专业背景。有从事分子诊断工作的经历。
分子诊断实验室操作人员应具备相关资质并经过有资质的培训机构培训合格取得上岗证后方可上岗。
签发分子病理报告的医师应至少具有中级病理学专业技术职务任职资格，并有从事分子病理工作的经历。
签发分子遗传报告的医师应至少具有中级遗传学专业技术职务任职资格，并有从事分子遗传工作的经历。
5.1.3 岗位描述
实验室应至少具有2名本单位在职检验/检查人员。开展遗传性疾病或基于组织、细胞等分子病理并出具诊断报告的实验室，应至少具有1名具备出具相关诊断报告资质的医师。
5.1.9 人员记录
应每年评估员工的工作能力。对新进员工在最初6个月内应至少进行2次能力评审，保存评估记录。
当职责变更时，或离岗6个月以上再上岗时，或政策、程序、技术有变更时，应对员工进行再培训和再评估，合格后才可继续上岗，并记录。
5.2 设施和环境条件
5.2.1 总则
应实施安全风险评估，如果设置了不同的控制区域，应制定针对性的防护措施及合适的警告。
5.2.2 实验室和办公设施
涉及基因扩增检验的实验室原则上分四个独立的工作区域：试剂贮存和准备区；样品制备区；扩增区；扩增产物分析区。如使用自动分析仪（扩增产物闭管检测），扩增区和扩增产物分析区可合并。具体实验室分区应依据其所使用的技术平台及检验项目和工作量而定。
开展下一代测序（NGS）技术的实验室设置遵循“工作有序、互不干扰、防止污染”的基本原则。
开展孕妇外周血胎儿游离DNA产前筛查与诊断的实验室，标本制备区不能与其他项目的标本制备区共用。
上述每个区域应有充足空间以保证：
-样品处置符合分析前、后样品分区放置；
-仪器放置符合维修和操作要求；
-样品制备区放置生物安全柜、离心机和冰箱等仪器设备；
-打印检验报告时交叉污染的控制。
工作区域应符合如下要求：
c）实验室各分区应配置固定和移动紫外线灯，波长为254 nm，照射时离实验台的高度一般为60～90 cm；
e）样品制备区应配置二级生物安全柜和洗眼器，实验室附近应有喷淋装置。
所有分子病理实验室均应设置独立的标本前处理区，包括切片区和脱蜡区，用于组织切片、脱蜡、水化、染色等。脱蜡、水化及染色应在通风设施中进行。
5.2.3 储存设施
用以保存临床样品和试剂的设施应设置目标温度和允许范围，并记录。实验室应有温度失控时的处理措施并记录。
5.2.6 设施维护和环境条件
不同的实验区域应当有其各自的清洁用具以防止交叉污染。工作结束后应立即对工作区进行清洁，必要时进行消毒及去污染。
应依据所用分析设备和实验过程的要求，制定环境温湿度控制要求并记录。应有温湿度失控时的处理措施并记录。
扩增仪应配备不间断电源（UPS）；
应依据用途（如：RNA检测用水），制定适宜的水质标准（如：应除RNase），并定期检测。
分子检验各工作区域应有明确的标记。进入基因扩增实验室各工作区应按照单一方向进行，即试剂贮存和准备区→样品制备区→扩增区→扩增产物分析区。不同的工作区域宜使用不同的工作服（如不同的颜色）。工作人员离开各工作区域时，不应将工作服带出。
5.3 实验室设备、试剂和耗材
5.3.1 设备
5.3.1.1 总则
如从事RNA检测，宜配备-70℃的冷冻设备。需要时，配备高速冷冻离心机。标本制备区使用的一次性加样器吸头应带有滤芯。PCR试验用容器应可密闭，不同工作区域内的设备、物品不能混用。
组织标本前处理区的设备通常应包括切片机、裱片机、切片刀、电热恒温箱、脱蜡缸、水化缸及HE染色缸等。
5.3.1.4 设备校准和计量学溯源
实验室应建立设备的校准程序，相应程序中至少应包括需校准的设备、校准单位、校准周期、校准参数、校准参数符合相关检验目的和要求等内容。需内部比对、校准的辅助设备，实验室宜根据国家计量部门或生产厂商的规定制定比对或内部校准操作规程和要求。
应按国家法规要求对强检设备进行检定。应进行外部校准的设备，如果符合检测目的和要求，可按制造商校准程序进行。应至少对分析设备的加样系统、检测系统和温控系统进行校准（适用时）。分析设备和辅助设备的内部校准应符合CNAS-CL31《内部校准要求》。
应定期对测序仪、基因扩增仪、杂交仪、加样器、微量分光光度计、温度计、恒温设备、离心机和生物安全柜等进行校准。有合格的校准报告，并对校准参数实施评估。当校准给出一组修正因子时，应确保之前的校准因子得到正确更新。
测序仪校准参数宜至少包括：缓冲液液路、光路、反应温度。
扩增仪校准参数宜至少应包括：温度示值误差、温度均匀度、平均升温速率、平均降温速率、样本示值误差和样本线性，技术性能指标应满足JJF 1527—2015《聚合酶链反应分析仪校准规范》的要求。
高速冷冻离心机校准参数宜包括：转速和温度（适用时）。
恒温金属浴的校准宜包括：温度示值误差和温度均匀度，并覆盖常用的检测温度。(https://www.daowen.com)
移液器的检定应包括：容量允许误差和测量重复性，计量性能要求应符合JJG 646—2006《移液器检定规程》的规定。
5.3.1.5 设备维护与维修
设备故障后，应首先分析故障原因。如果设备故障可能影响了方法学性能，故障修复后，可通过以下合适的方式进行相关的检测、验证：
a）可校准的项目实施校准验证，必要时，实施校准；
b）质控物检验，其检验结果在允许范围内；
c）与其他仪器或方法比对；
d）以前检验过的样品再检验。留样再测判断标准：按照项目稳定性要求选取最长期限样品。
定性项目：选择阴性和弱阳性样品各1份，测量结果与预期结果一致。
定量项目：选取5份样品，覆盖测量区间，至少4份样品测量结果偏倚＜±7.5%。
5.3.2 试剂和耗材
5.3.2.1 总则
实验室应建立试剂和关键耗材（如离心管、带滤芯的吸头）的验收程序，相应程序中应有明确的判断符合性的方法和质量标准。
5.3.2.3 试剂和耗材的验收试验
实验室应对新批号或同一批号不同货运号的试剂和关键耗材进行验收，验收试验至少应包括：
a）外观检查：肉眼可看出的，如包装完整性、有效期等；
b）性能验证：通过实验才能判断的，如试剂的核酸提取效率和核酸扩增效率、试剂的批间差异、关键耗材的抑制物等。
试剂性能验证记录应能反映该批试剂的核酸提取效率和核酸扩增效率。一般情况下，临床实验室在新批号试剂或关键耗材使用前，应验证试剂批间差异和耗材的抑制物，符合下列要求即可视为满足要求。特殊情况下，如实验室怀疑提取试剂有质量问题，可采用凝胶电泳试验比较核酸提取物与核酸标准物确认核酸片段提取的完整性、260 nm紫外波长测定确认核酸提取的产率、260 nm/280 nm比值确认核酸提取的纯度。
-用于定性检验的试剂，选择阴性和弱阳性的样品进行试剂批号验证。
-用于定量检验的试剂，应进行新旧试剂批间的差异验证，选取5个旧批号检测过的样品，覆盖测量区间（包括阴性、临界值、低值、中值和高值），至少4个样品测量结果偏倚＜±7.5%，其中阴性和临界值样品必须符合预期。
-耗材的抑制物验收（除非已标明不含抑制物）：对关键耗材应检测是否存在核酸扩增的抑制物，选取5个旧批号检测过的样品，覆盖测量区间（包括阴性、临界值、低值、中值和高值），至少4个样品测量结果偏倚＜±7.5%，其中阴性和临界值样品必须符合预期。
5.4 检验前过程
5.4.4 原始样品采集和处理
5.4.4.3 采集活动的指导
应规定分子诊断样品留取的具体要求，如：
a）使用无DNase和（或）无RNase的一次性密闭容器；
b）正确使用抗凝管：通常全血和骨髓样品应进行抗凝处理，EDTA和枸橼酸盐为首选抗凝剂，不使用肝素抗凝（核酸提取采用吸附法而不受肝素干扰时除外）；
c）用于RNA（如HCV RNA）扩增检测的血样品宜进行抗凝处理，并尽快分离血浆，以避免RNA的降解；如未作抗凝处理，则宜尽快分离血清；
d）分泌物、拭子、肿瘤组织等样品留取的注意事项等。
5.4.5 样品运送
样品运送应符合相关时间、温度、生物安全的要求。
5.4.6 样品接收
c）当标本验收不合格，如患者识别或样品识别有问题、运送延迟或容器不适当导致样品不稳定、样品量不足，样品对临床很重要或样品不可替代，而实验室仍选择处理这些样品，应在最终报告中说明问题的性质，并在结果的解释中给出警示（适用时）。
示例：脑脊液、关节腔穿刺液等。
e）基于组织/细胞学形态基础的分子检测项目应由具有病理诊断资质的医师确认样品是否满足检测要求。
所有取自原始样品的部分样品应可明确追溯至最初的原始样品。
标本检测全过程包括核酸提取、扩增、产物分析、保存等应能溯源至原始标本。
分子病理检测项目在检测过程中应以病理号作为原始标本、取材标本（包埋盒）、蜡块或切片的唯一性标识。
孕妇外周血胎儿游离DNA产前筛查与诊断的实验室的采血管应当为唯一编号，该编号应当与知情同意书、检测申请单和临床报告单编号一致。
5.4.7 检验前处理、准备和储存
样品应尽快处置并以适当方式储存，以尽可能减少核酸降解。超长期储存后的标本，使用前应再次评估标本的完整性。标本储存应避免反复冻融，确保样品的完整性。
用于分子病理检测样品若为组织，应采用10%中性缓冲的福尔马林固定，固定液的量和固定时间应符合检测要求。
用于分子病理检测的石蜡包埋组织标本应按要求及时进行切片、脱蜡等处理，新鲜组织标本应及时进行取材作冰冻切片或切开、固定等处理，穿刺细胞应及时进行制备细胞蜡块、切片等处理。
组织标本如需要用显微切割法刮取组织以保证有足量的肿瘤细胞，应由经验丰富的工作人员评估，标注出肿瘤细胞所在区域。
5.5 检验过程
5.5.1 检验程序的选择、验证和确认
5.5.1.2 检验程序验证
定量检测方法和程序的分析性能验证内容至少应包括精密度、正确度、线性范围、检出限等。定性检测项目验证内容至少应包括精密度、特异性、准确度（方法学比较或与金标准比较）等。验证结果应经过授权人审核。
应使用验证过的核酸抽提和纯化方法，必要时进行核酸定量。
对产前检验，在完成分子诊断前应保留备份培养物并跟踪监测实验的准确性；在检验胎儿标本前，应检验父母一方或双方的突变状态，宜由同一实验室检验；如有足够的标本，应从两份不同标本中提取DNA进行双份检验。实验室应了解检验方法受母体细胞污染的影响，应有程序评估并减少这种影响。
应有明确和统一的原位杂交（ISH）阳性信号的标准，并建立本实验室的阳性阈值。组织病理ISH，应结合组织形态进行结果判读，并采用国际通用的评分标准。
5.5.1.3 检验程序的确认
如开展分子诊断自建项目，应有程序评估并确认精密度、正确度、参考范围、可报告范围、分析灵敏度、分析特异性等分析性能符合预期用途，必要时还需进行临床验证。确认结果应经过实验室负责人审核并签字。
5.6 检验结果质量保证
5.6.2 室内质量控制
5.6.2.1 总则
应制定室内质量控制程序，定量测定可参照GB/T 20468—2006《临床实验室定量测定室内质量控制指南》。质量控制程序中应有针对核酸检测防污染的具体措施。
如检测过程中对被检基因组DNA质量有规定时，应符合制造商规定的要求，并保留DNA质量评价记录。需要时，应对RNA的质量进行评价，并选择合适的“管家”mRNA作为内对照以评价所提取RNA的完整性，并保留RNA质量评价记录及假阴性率监测记录。
对用于基因突变检测的石蜡包埋样品，应有病理医师从组织形态学对肿瘤细胞的存在与否及其数量进行评价，并决定是否需要对肿瘤细胞进行富集。
当分子诊断结果与临床和其他实验结果不符时，应记录并分析原因，适当时采取纠正措施。
5.6.2.2 质控物
定性检测项目，每次实验应设置阴性、弱阳性和（或）阳性质控物。如为基因突变、基因多态性或基因型检测，则应包括最能反映检测情况的突变或基因型样品，每批检测的质控至少应有一种基因突变或基因型，并建议在一定周期内涵盖所有基因突变或基因型。
定量检测项目，每次实验应设置阴性、弱阳性和阳性质控物。
5.6.2.3 质控数据
质控规则应确保试验的稳定性和检验结果的可靠性。
定量项目质控规则建议采用多规则控制或6σ质控规则。实验室应根据统计学质控方法建立检测项目的控制限。
定量检测项目质控图应包括质控结果、质控物名称、浓度、批号和有效期、质控图的中心线和控制界线、分析仪器名称和唯一标识、方法学名称、检验项目名称、试剂和校准物批号、每个数据点的日期和时间、干扰行为的记录、质控人员及审核人员的签字、失控时的分析处理程序和纠正措施等。
定性检测项目：阴阳性符合预期。
检测项目结果有效性判断除室内质控结果在控外，还应判断相关参数是否满足试剂说明书的要求。
使用NGS技术，应根据制造商要求建立并执行检测过程中相关数据的质量参考标准。需评价NGS性能检测的特征性质量控制参数，包括：覆盖深度、序列覆盖一致性、用于评价碱基识别和比对的质量值等。
5.6.3 实验室间比对
5.6.3.1 参加实验室间比对
应按照CNAS-RL02《能力验证规则》的要求参加相应的能力验证/室间质评。应保留参加能力验证/室间质评的结果和证书。实验室负责人或指定人员应监控室间质评活动的结果，并在结果报告上签字。本专业室间质评允许误差范围见《各专业质量控制允许误差范围》（附录G）。
5.6.3.2 替代方案
对没有开展能力验证/室间质评的检验项目，应通过与其他实验室（如已获认可的实验室、使用相同检测方法的实验室、使用配套系统的实验室）比对的方式确定检验结果的可接受性，并应满足如下要求：
a）规定比对实验室的选择原则；
b）样品数量：至少5份，包括正常和异常水平或不同常见基因突变或基因型；
c）频率：至少每年2次；
d）判定标准：应有≥80%的结果符合要求。分子病理、药物基因组学、产前筛查与诊断应100%符合。
比对结果不一致时，应分析原因，并采取有效的纠正措施，及时评估纠正措施的有效性。
5.6.4 检验结果的可比性
实验室使用两套及以上检测系统检测同一项目时，应有比对数据表明其检测结果的一致性，比对频次每年至少1次，样品数量不少于20份，浓度水平应覆盖测量区间；计算回归方程，系统误差应＜±7.5%。应定期（至少每年1次，每次至少5份临床样品）进行检验人员的结果比对、考核并记录。比对结果至少4个样品测量结果偏倚＜±7.5%，其中阴性和临界值样品必须符合预期。
使用不同生物参考区间的检测系统间不宜进行比对。
比对记录应由实验室负责人审核并签字，并应保留至少2年。
5.7 检验后过程
5.7.1 结果复核
应制定定性检测项目临界标本的复检制度，复检范围和结果报告规则遵从试剂说明书规定的要求。
NGS检测显示为影响临床决策的核酸变异结果，在签发报告之前，需要另外采用备选方法（如Sanger测序、SNP芯片等）对其进行确认。
5.7.2 临床样品的储存、保留和处置
原始样品、核酸提取物和（或）核酸扩增产物应规定保存期，便于复查。为便于追溯，凝胶图像和斑点杂交条带和（或）通过扫描、拍照等方式保留的结果应作为技术记录予以保存，保存期限参照相关行业要求。
5.8 结果报告
5.8.1 总则
开展孕妇外周血胎儿游离DNA产前筛查与诊断的实验室应规定明确的检验周转时间（TAT）：自采血至发放临床报告时间不超过15个工作日，其中发出因检测失败须重新采血通知的时间不超过10个工作日。
5.8.3 报告内容
除了通用要求外，适用时，分子诊断报告内容还应包括特定信息：检测方法、检验程度的详细信息、分子遗传学检验项目需提供基因参考序列、涉及肿瘤病理标本需说明肿瘤细胞的百分比信息、方法的局限性、进一步检测的建议、相关咨询人员姓名及联系方式。
临床基因检验诊断报告中术语描述应规范，应使用国际权威组织或数据库发布的最新标准命名。
基因名称应依据人类基因命名委员会（HGNC）的指南原则命名。
对于测序发现的序列变异，应参照当前的人类基因组变异协会（HGVS）指定的规则进行描述。
对于细胞遗传和微阵列芯片，应采用最新版本的人类细胞遗传学国际命名体制（ISCN）的标准命名。
药物治疗相关基因检测项目其报告内容必要时宜有结果解释或用药建议等相关信息。
5.9 结果发布
5.10 实验室信息管理