4.3.1 代谢与高血压肾病
代谢环境异常与高血压和慢性肾脏疾病之间有着密切的联系。研究显示，高血压患者更容易合并代谢异常。随着高通量组学技术的发展，代谢组学迅速渗透到多个领域，对疾病诊断、靶点发现、新药研发具有重要意义。除了传统的糖、脂、氨基酸三大代谢外，近年来越来越多的工作者将目光聚焦于花生四烯酸代谢、肠道微生物代谢等新兴领域。我们从代谢组学切入，重点探讨新兴代谢领域与高血压肾病的相关研究。
（1）组学与高血压肾病
高血压肾病是指长期存在的原发性高血压引起的肾脏结构和功能损害，当高血压和肾脏损害同时存在时，两者互为因果，相互加重，最终导致机体恶化。然而关于高血压肾病的诊断尚无明确的标志物，且没有特征性的病理表现，主要依靠医生的临床诊断。因此，通过组学技术从大量的临床资料、血尿生化参数或病理图像中找到特异性的诊断和治疗标志物，对高血压肾病的诊疗具有十分重要的意义。近年来，高通量和高含量的组学方法已经彻底改变了生物标志物的研究，特别是利用代谢组学技术在组织、血浆、血清和尿液样本中进行精确的分析，寻找慢性肾脏疾病的新的生物标志物。代谢产物被认为是生理稳态和基因-环境相互作用的最终代谢物，反映了机体当下或已经发生的病生理过程。在疾病诊疗中，将机体的代谢产物分析与现有的临床生化参数和临床资料联合使用，在对患者的诊断以及患者的分层和监测治疗方面具有巨大的潜力。
高血压肾硬化是终末期肾脏疾病的主要原因之一，但对其病生理学知之甚少。Marius等通过基因表达和靶向代谢组学分析探索高血压肾硬化早期的代谢变化。他们利用Affymetrix 阵列分析了20例肾硬化患者和31名健康对照者肾脏活检组织的基因表达，以及采用液相色谱-质谱联合技术对62例临床高血压肾病硬化患者和33例健康对照患者的尿液样本中的氨基酸进行测定分析。整合基因代谢途径分析显示，早期高血压肾硬化表现为肾内多巴胺生物合成紊乱，而多巴胺调节利尿和血压。同时，丝氨酸/甘氨酸和蛋氨酸/同型半胱氨酸代谢显著紊乱，以上可能导致内皮功能障碍、动脉粥样硬化和肾纤维化。此外，最近的一项研究应用代谢组学、磷酸化蛋白质组学和蛋白质组学系统地分析了高血压对肾脏的影响。他们建立高血压和蛋白尿Dahl 盐敏性大鼠模型，通过非靶向代谢组学分析显示在肾小球中脂质代谢、支链氨基酸和脯氨酸发生改变。靶向代谢组学分析显示，氧化应激和能量代谢物耗竭主要发生在肾小球，进而触发mTOR和AMPK 重组。而蛋白质组学的结果显示，代谢过程中酶学的改变是肾小球疾病的一个重要特征。以上多组学分析提示，代谢信号控制了肾小球的主要病生理通路，揭示了代谢物、磷酸化蛋白质和蛋白质之间在肾小球疾病中复杂的相互作用。
（2）花生四烯酸代谢
花生四烯酸（arachidonic acid）属于Omega-6 族长链多不饱和脂肪酸，是体内一种必需脂肪酸，同时也是机体内很多生物活性物质的前体。生理状态下，花生四烯酸能够与磷脂结合形成结构脂类存在于细胞膜上，当细胞膜受到来自内源性或外源性的各种刺激时，在磷脂酶A2和磷脂酶C的催化下从磷脂池中游离出来。游离出的花生四烯酸在环氧化酶（COX-1/2）、脂氧酶（LOX）和细胞色素P450（CYP450）3大类花生四烯酸代谢酶的作用下产生上百种具有脂质活性的代谢产物。近年来，花生四烯酸代谢和高血压肾病的研究多集中在CYP450代谢通路，如图4.2所示。在肾脏中，CYP 途径能够产生2种类型的二十烷酸产物，一种是由CYP450 表氧化酶形成的环氧二十碳三烯酸（EET），另一种由CYP450羟化酶形成的羟基二十碳四烯酸（HETE）。EET通过可溶性环氧化物水解酶水解为二羟基二十碳三烯酸（DHET）。此外，有研究发现COX 途径在高血压肾损伤中也有一定的作用。
图4.2 花生四烯酸CYP450和环氧化酶代谢途径流程图
1）细胞色素P450 表氧化酶途径
EET 主要在肾脏的微血管产生，对肾脏的保护作用主要体现在其能够舒张血管、降血压、抗炎等。抑制环氧化物水解酶是提高EET水平的一种方式，该酶主要负责将具有生物活性的EET 转化为无活性的DHET。在血管紧张素诱发的高血压大鼠模型中发现肾微血管的环氧化物水解酶蛋白表达增加。在该模型中使用环氧化物水解酶特异性抑制剂1-环己基-3-十二烷基脲，发现入球小动脉的直径对血管紧张素的反应显著降低，尿白蛋白的水平也较低。组织学证实肾血管系统和肾小球也得到了很好保护。该研究表明，抑制环氧化物水解酶在血管紧张素诱发的高血压大鼠中具有抗高血压和肾血管保护作用，提示抑制环氧化物水解酶可能是一种治疗高血压肾病的有效手段。另有研究发现，过氧化物酶体增殖激活受体-α（PPAR-α）激活剂非诺贝特能够诱导肾脏CYP2C23的活性，提高11，12-EET的形成，发挥抗炎作用，并抑制核因子-κB的活化，保护血管紧张素诱导的肾损伤。
2）细胞色素P450 羟化酶途径
很早就有人提出并证实CYP4A 基因表达增加是高血压发生的早期事件。20-HETE是一种CYP450 衍生的花生四烯酸代谢物，由CYP4A和CYP4F 家族催化产生，具有血管和肾脏功能调节的作用。在血管系统中，20-HETE能够增加血管平滑肌细胞对收缩刺激的敏感性，同时增加肌源性张力。20-HETE通过促进平滑肌细胞的迁移和增殖，以及通过作用于血管内皮导致内皮功能障碍、血管紧张素转换酶高表达和炎症反应促进血管重构和血压升高，其升血压的作用主要是通过激活肾素-血管紧张素-醛固酮系统和诱发肾脏纤维化。另有研究发现，在给予自发性高血压大鼠十六酰胺乙醇处理后，血压显著降低，并限制了高灌注压力引起的肾脏损害，其机制进一步被证实是通过降低CYP4A、CYP2C23和可溶性环氧化物水解酶在肾脏中的表达，伴有尿中20-HETE 排泄的减少。为详细探讨高血压肾病的分子机制，Chen等基于基因表达谱确定高血压肾病的潜在候选基因。结果显示，在PPI 网络中CYP3A4和血管紧张素Ⅱ1型受体作用程度较高，CYP3A4和CYP4A11可以相互作用。在miRNA-DEG 调控网络中，hsa-miR-26b-5p和hsa-miR-335-5p 最为显著，初步预测结果显示CYP3A4、CYP4A11和血管紧张素受体1型等可能是通过hsa-miR-26b-5p 调控参与某些途径，在高血压肾病的发生发展中发挥关键作用。
3）环氧化酶途径
花生四烯酸COX代谢途径产生的前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）在肾脏生理功能中起着重要作用，能够调节血管平滑肌细胞的张力、肾小球滤过、肾素释放、肾小管水钠的转运等。在高血压肾病中，PGE2的生成明显增强，作用于EP1～EP4 4个受体亚型，发挥着不同的生理作用。给予中风倾向的自发性高血压大鼠EP1受体拮抗剂，发现转化生长因子的表达和肾小管间质纤维化程度都明显下调，同时可显著抑制尿蛋白的排泄，表明PGE2/EP1 信号通路在治疗高血压肾病中具有重要的意义。(https://www.daowen.com)
（3）肠道菌群与高血压肾病
人体肠道是一个由100万亿个微生物细胞组成的复杂群落，每一种细菌都占据一个特定的生态位。肠道菌群能够执行多种生物功能，被认为是一个代谢活跃的内源性“器官”。生理条件下，肠道菌群参与完成人体宿主尚未完成的代谢活动，如特定维生素的合成、结合胆汁酸的生物转化、植物多糖的分解等。此外，肠道菌群还参与调节人体的免疫系统。肠道菌群与宿主之间的相互作用因参与多种学科疾病的发生发展而引起广泛的关注。慢性肾脏疾病通常与高血压相关，其特征是代谢紊乱、免疫失调和交感神经活化等，这些都与肠道菌群失调和易位相关。近年来，慢性肾脏疾病和高血压患者的肠道、微生物群和肾脏之间复杂的相互作用逐步形成了肠-肾轴的假说，另外也有人支持脑-肠-肾轴的假说，如图4.3所示。多项研究发现慢性肾脏疾病患者肠道菌群的数量和质量发生了改变，干扰了人体与菌群之间的共生平衡，肠道菌群与肾脏的生物学功能之间存在密切的相关性。
图4.3 肠道菌群紊乱和内源性代谢产物失调导致肾损伤（参考Chen、Yang、Ali等）
1）短链脂肪酸
短链脂肪酸是肠道菌群产生的一类代谢物，通常是指直链2～4个碳的乙酸盐、丙酸盐和丁酸盐，据报道能够促进人类健康。大多数膳食纤维不能被上消化道的宿主酶降解，所以这些纤维会顺着消化道进入结肠和盲肠被肠道菌群分解产生短链脂肪酸，后者可以通过单羧酸转运体进入宿主的循环系统。多项研究发现短链脂肪酸对血压有很好的调控作用，机制主要是通过调节Olfr78和Gpr41的表达。短链脂肪酸通过肾入球小动脉处的Olfr78 来增加肾素的释放提高血压，也作用于周围血管系统的Gpr41 舒张血管强烈地降低血压。当短链脂肪酸处在低水平或基础水平时，Gpr41 更可能被激活，因此主要驱动血管舒张。然而，当短链脂肪酸明显升高时，Olfr78 将被激活，从而抑制血管舒张防止低血压的出现。
慢性肾脏疾病与高血压密切相关，越来越多的证据支持短链脂肪酸参与慢性肾脏疾病的预后。Wong等发现终末期肾病患者体内能够产生尿毒症毒素酶的细菌家族显著增加，而具有降解纤维并产生短链脂肪酸酶的细菌家族明显降低。在临床中，为避免高钾血症和磷酸盐的摄入，通常会限制慢性肾脏疾病患者摄入大量的富含纤维的食物。考虑到尿毒症毒素的有害作用和短链脂肪酸对肠道和肾脏的有益作用，推测肠道菌群紊乱和慢性肾脏疾病之间可能处在一个恶性循环中。最近Wang等针对能改善肾功能的短链脂肪酸的具体类型展开研究。他们招募127名慢性肾脏疾病患者和63名健康对照者，发现健康对照者中丁酸盐的水平比慢性肾脏疾病患者高3倍。向慢性肾脏疾病大鼠移植从慢性肾脏疾病患者中获得的肠道菌群，结果显示其能够通过增加三甲胺N-氧化物的产生加速大鼠慢性肾脏疾病的发展，而该过程可以通过补充额外的丁酸盐来逆转。总之，短链脂肪酸能够通过多种机制调节机体的血压水平，对包括高血压在内导致的慢性肾脏疾病有较好的保护作用。
2）免疫调节
此外，肠道菌群亦可通过免疫介导机制调节宿主的病生理功能。研究发现，在某些情况下，微生物的结构元素负责其免疫调节作用。给无菌小鼠注射B.fragilis的多糖A（PSA）可以促进T 细胞增殖，恢复TH1与TH2 效应细胞平衡，促进内脏相关淋巴组织的正常发育。B.fragilis还能够诱导产生具有免疫抑制作用的调节性T 细胞，改善结肠炎和PSA 依赖的多发性硬化小鼠疾病模型的进展。机制上，PSA与外膜泡相互作用，使TLR2与树突状细胞结合，进而诱导CD4+CD25+调节性T 细胞中IL-10的表达。在动物模型中，来自B.fragilis的糖鞘脂类也可以通过抑制肠道固有层NKT 细胞的增殖，减轻结肠炎的严重程度。有意思的是，肠道菌群产生的短链脂肪酸能够通过调节淋巴细胞的表观遗传学影响淋巴细胞的功能。研究显示，外周调节性T 细胞的诱导依赖共生菌群产生的丁酸盐，并在高纤维饮食的小鼠中增加。丁酸盐抑制组蛋白去乙酰化酶，进而导致Foxp3 位点的组蛋白乙酰化堆积和Foxp3蛋白丰度增加，而Foxp3 蛋白是调节T 细胞的重要调节因子。在T 细胞依赖性结肠炎模型中，饮食中的丁酸盐还可以降低疾病的严重程度，进一步支持了短链脂肪酸在调节淋巴细胞活动中的作用。
除了以上谈到的短链脂肪酸对血压的调控外，2017年的一项研究证实肠道菌群参与调控血压的免疫相关机制。给予小鼠高盐饮食14 d 诱发高血压，该疾病模型与小鼠乳酸杆菌水平降低和促炎Th17 细胞数量增加有关。在健康人群中也观察到了类似的结果，14 d的盐刺激导致血压升高，外周血中Th17 淋巴细胞数量增加，并降低乳酸菌菌株的肠道存活率。在无菌小鼠体内种植共生菌群会引起骨髓中炎症细胞因子的变化，而骨髓是免疫细胞的主要来源。细胞因子在造血中有重要的作用，抗生素介导的小鼠肠道菌群耗竭能够抑制骨髓多能祖细胞的表达。在一项临床研究中，接受骨髓移植的患者出现了肾功能障碍，并证实骨髓在引发肾脏炎症中发挥一定的作用。由于促炎细胞因子水平与蛋白尿的发生呈正相关，早期肾内炎症被认为是肾脏疾病的重要致病机制。此外，免疫相关的氧化应激和炎症反应的失调与慢性肾脏疾病中血清氨基酸、嘌呤和脂质代谢的紊乱有关，这些又与肠道菌群的代谢相关联。因此，肠道菌群很有可能会通过调节机体的免疫反应在高血压肾病中发挥一定的作用，该结论需要更多的数据支持，未来的研究应关注肠道菌群以及免疫在高血压肾病中的作用。
3）肠黏膜屏障功能障碍
肠黏膜屏障以机械屏障为主，肠黏膜上皮细胞和细胞间的紧密连接是机械屏障的结构基础，是有效阻止或抑制病原体和抗原系统易位进入血液循环的天然屏障。尿素能够被尿素酶水解产生氨和氨基甲酸酯，后者进一步自发分解生成第二分子氨和碳酸氢盐，而氨和水发生反应生成氢氧化铵。血液中的尿素能够弥散进入肠腔，并被细菌源性的尿素酶代谢，经上述过程产生氢氧化铵，侵蚀肠黏膜上皮屏障。肠道通透性的改变可能导致细菌从肠腔转移到循环系统，细菌产生的内毒素可以激活树突状细胞、巨噬细胞和血管内皮细胞上的模式识别受体，触发促炎细胞因子的产生和释放。以上提及的短链脂肪酸也是肠上皮细胞的重要营养来源，肠道菌群的紊乱抑制短链脂肪酸的产生也将危及肠黏膜屏障的功能。
在高血压患者中发现肠道脂肪酸结合蛋白、脂多糖和肠道靶向促炎Th17 细胞显著增高，提示肠道炎症和通透性增加。Zonulin是肠上皮紧密连接蛋白调节因子，在高血压患者中也显著增高，进一步支持高血压患者的肠黏膜屏障功能障碍。而给予慢性血管紧张素高血压小鼠丁酸盐处理，发现肠黏膜屏障功能得到很好的改善。新的证据表明，在血管紧张素诱发的高血压动物模型中，肠道紧密连接蛋白的变化可能是由交感神经活性增强引起的，从而增加黏膜屏障的通透性和肠道炎症，导致肠道微环境失衡。此外，肠黏膜屏障通透性的增加还可能是由肠道菌群紊乱引起的调节性T 细胞活性改变的结果。尿毒症是慢性肾衰的终末期阶段，研究发现尿毒症和慢性肾脏疾病的患者肠通透性均明显增加。发生尿毒症时，过量的氨会引起肠道内pH 值升高，刺激并损害结肠上皮，导致肠道紧密连接蛋白丢失和黏液分泌减少，最终导致肠黏膜屏障功能障碍。结肠上皮紧密连接的中断可能导致细菌和内毒素的跨肠壁转运进入血液循环并到达肾脏，从而加重肾脏的炎症状态，进一步损伤肾功能。