泪液蛋白质组学研究进展
泪液是一种复杂的生物复合体，包括电解质、蛋白质、脂类、黏蛋白、某些有机小分子和代谢物。泪膜是覆盖于眼球前表面约7 μm厚的一层液体，为眼表结构的重要组成部分。泪膜的功能包括润滑、防御疾病和营养角膜，同时在眼的光学特性中起着关键性作用。通常结膜囊内的泪液储存量约为7～10 μl，分泌速度大约1.2 μl/min，转移率大约16%/min。泪膜包括3层组织：最内层的黏液层，中间的水液层含有电解质、蛋白质和多种代谢物，以及最外层的脂质层。正常泪液的蛋白质总量为6～10 mg/ml。
正常流泪及反射性流泪的泪液（源于角膜神经受刺激）由主泪腺分泌，而基础泪液则主要由副泪腺分泌。泪液总量虽少，但却含有丰富的蛋白质、多肽、电解质、脂质及小分子代谢物，这些成分主要来源于主泪腺、副泪腺、眼表上皮细胞、杯状细胞、睑板腺及血液中的渗出液等。泪膜从外向内由脂质层、水样层和黏蛋白层构成，表面的脂质层主要由睑板腺分泌，最近研究发现脂质层可进一步分为外层非极性脂质层及含有嵌入蛋白的内层极性脂质层。泪液表面的脂质层能够阻止水样层泪液蒸发过快，保证泪膜的稳定，同时也是防止微生物滋生的屏障；泪液中间的水样层主要由主泪腺及副泪腺分泌，含有丰富的钠、钾、钙、镁、氯、磷、碳酸氢盐等电解质，以及酶、生长因子、细胞因子等蛋白/多肽和氨基酸、尿素、乳酸盐等小分子代谢物；而泪液内层的黏蛋白层紧贴眼表细胞，主要由眼表上皮细胞和结膜杯状细胞分泌，泪腺也分泌少量黏蛋白成分。目前为止已报道的不同的泪液蛋白质超过500种，并且可能远不止这些。主要的泪液蛋白质包括溶菌酶、乳铁蛋白、分泌型sIgA、白蛋白、lipocalin（以前叫做泪液特异性前白蛋白）和脂蛋白等。
蛋白质组（protome）的概念最早是由澳大利亚学者Wilkins和Williams首先提出，现在的定义是指一个给定的细胞、组织、器官或完整的生物体拥有的全部蛋白，其与基因组的差别为蛋白质组具有多样性和动态变化，与细胞的类型、功能状态有关，易受疾病和外部因素影响。蛋白质组学（protomics）就是研究各细胞、组织、器官和机体总的蛋白质的科学，即在功能水平上研究基因的表达。正因为如此，蛋白质组学研究成为新世纪生命科学研究的前沿。
泪液蛋白质组学是眼科研究中的一个热点。毫无疑问蛋白质组学能够提供一个全面的方法来分类所有的泪液蛋白质，包括阐明疾病的发病机制，可用于临床诊断和评价药物对泪液蛋白质的结构、成分和分泌的影响。近年来，蛋白质组学方法已越来越多地应用于泪液蛋白质的研究，研究发现泪液蛋白质的异常与疾病有密切的联系。泪液蛋白质的改变不仅仅见于眼表疾病如干眼症，还可见于其他全身性疾病如糖尿病、戴接触镜或吸烟的患者。
一、 蛋白质组学的研究方法
1. 二维电泳研究·二维电泳（two-dimensional electrophoresis, 2-DE）技术于1975年首先由O’Farrell等创立，其原理是在相互垂直的两个方向上，分别基于蛋白质不同的等电点和分子量，运用等电聚焦电泳（isoelectric focusing, IEF）和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）把复杂的蛋白质成分分离。该技术主要用于分离细胞或组织蛋白质抽提物，构建特定组织或细胞蛋白质的“二维电泳图谱”，分析特定条件下蛋白质的表达状况，进行蛋白质组差异比较。完整的二维电泳技术包括样品制备、等电聚焦、平衡转移、SDS-PAGE、斑点染色、图像捕获和图谱分析等步骤。随着样品制备方案的完善、固相pH梯度（immobilized pH gradient, IPG）二维电泳的应用、染色方法的改进和图像分析软件性能的提高，2-DE技术凭借其高通量、高灵敏度、高分辨率和重复性好，便于计算机进行图像分析处理，可以很好地与质谱分析等鉴定方法匹配的优点，已成为蛋白质组学研究中最常用的蛋白质分离技术。
二维电泳是蛋白质组学研究中的一个里程碑。因为与一维电泳技术相比，它分离蛋白质的容量和效率大大提高。利用这种技术，可分析和定量泪液中的单个蛋白质，并可建立起泪液蛋白质图谱。尽管二维电泳技术是一种非常有效的蛋白质分离工具，但是在处理分子量过大（＞200 000）或过小（＜10 000）、极酸或极碱性、疏水性蛋白质或低丰度蛋白质等方面有一定的局限性，而且操作费时。
2. 液相色谱分离研究（liquid chromatography, LC）·凝胶中的蛋白质点需要切割、抽提、脱色，然后才能进行质谱分析，这难以实现高通量的蛋白质分析，在准确性上也不理想。目前无胶（即在溶液状态）的分析技术得到迅速发展，其能获得各种完整蛋白质的样品，可完整保存全蛋白质图谱信息或完整蛋白质本身。LC主要是利用蛋白质等电点、疏水性和分子量的特性来对蛋白质进行分离。
1997年，Opiteck等首次报道了将蛋白质混合物直接通过LC分离，然后进入质谱分析（mass spectrometry, MS）。这是近年来发展起来的新方法，其优点在于操作简单、自动化程度高；提高了进样量而不影响分离效果；改善了低丰度蛋白质、膜蛋白或疏水性强的蛋白质、分子量特别大和特别小的蛋白质等分离及检测能力，重复性好，回收率高，可保持蛋白质的完整性和活性。
3. 质谱分析研究·对2-DE等技术分离的蛋白质进行鉴定是蛋白质组学研究的重要内容，MS无须纯化蛋白，可同时鉴定多个蛋白质，具有灵敏度高、准确度高、易自动化的特点，已逐步取代了传统的Edman降解测序与氨基酸组成分析法，是目前蛋白质组鉴定的核心技术。用于蛋白质鉴定的质谱依电离源不同分为两种：电喷雾离子化质谱（electrosprayionization mass spectrometry, ESI-MS/MS）和基质辅助的激光解吸质谱（matrix assisted laser desorption/ionization mass spectrometry, MALDI-TOF-MS）。蛋白质鉴定主要通过蛋白质的分子量、等电点、氨基酸组成、肽质量指纹谱、肽MS-MS数据再经蛋白质数据库检索得到结果。其特点是高敏感性、快速、直接提供样品的分子量和结构信息，并可与色谱联用。其缺点是仪器价格昂贵、检测通量不高、有信息损失及不够简化等。
4. 蛋白质芯片研究·为适应大规模的筛查和临床检测，近年来产生了蛋白质芯片，即把探针蛋白高密度排列在固相支持物表面，通过探针特异性地捕获样品中的靶蛋白并进行定性、定量分析，具有高通量、微型化及自动化操作、结果重复性好等优点。
蛋白质芯片表面加强激光解吸电离-飞行时间-质谱（surface enhanced laser desorption/ ionization time of flight-mass spectrometry, SELDI-TOF-MS）技术是蛋白质组学研究中一种全新的技术平台，其主要由蛋白质芯片、飞行质谱和分析软件三部分组成。分析过程中不会破坏蛋白质，整合蛋白质样品处理、生化反应及检测分析过程为一体，实现了新型、高效、快速、高通量、高灵敏度的检测。而且可直接对泪液样本进行分析，泪液样本用量少，只需要2～3 μL，检测灵敏度可高达1 fmol（10-15 mol），特别适合低丰度、小分子量蛋白的发现。而传统的二维电泳联合质谱的一次分析通常需要10 μl或更多的泪液样本。Zhou等应用SELDI-TOF技术对病理情况下的泪液进行检测，在眼表外伤患者泪液中发现了a-denfensin 1、a-denfensin 2和a-denfensin 3（相对分子质量分别为3 442、3 371和3 486），且在翼状胬肉患者泪液中发现了S100 A8（相对分子质量为10 800）和S100 A9（相对分子质量为12 700）。SELDI/MALDI-TOF技术是一种快速、简单的泪液蛋白检测方法，但仅能鉴定蛋白/肽类的相对分子质量，后续的鉴定步骤则繁琐而缓慢。
5. 同位素标记相对和绝对定量技术·研究的发展需要更加高效的蛋白质组学研究方法对成百上千的蛋白进行定量分析。同位素标记相对和绝对定量（isobaric tags for relative and absolutequantitation, iTRAQ）技术是一种体外同重同位素标记，利用多种同位素试剂标记蛋白多肽N末端或赖氨酸侧链基团，经高精度质谱仪串联分析同时比较多达8种样品之间的蛋白表达量，是近年来定量蛋白质组学常用的高通量筛选技术。应用iTRAQ技术可同时对病理状态下（如干眼、青光眼）的泪液蛋白和正常对照泪液蛋白进行检测，鉴定患者泪液中的蛋白标志物，也可用于治疗前后泪液蛋白表达量的动态分析。
6. 抗体相关蛋白检测方法·近年来抗体相关蛋白检测方法也得到发展，如基于质谱多反应监测技术（MRM-MS）和同位素标记标准肽段的蛋白质定量技术。稳定同位素和多肽抗体捕获（stable isotope standards and capture by anti-peptideantibodies, SISCAPA）技术可应用免疫亲合法富集和稀释同位素，并联合MRM-MS技术，以达到对候选标志物进行定量的目的。流式微球分析技术（cytometric bead-based assay, CBA）是建立在免疫微球、ELISA和流式细胞分析等技术基础上的一种新的血清学实验方法，其主要机制是将不同的单克隆抗体结合到微球的不同位点表面，已应用于人类泪液的多重细胞因子检测。抗体蛋白芯片具有微型化、集成化、高通量化的特点，可检测某一特定的生理或病理过程中相关蛋白的表达丰度。这些抗体相关蛋白检测系统具有超敏感和同时检测多种蛋白的特点，但其局限性在于必须通过目标抗体进行目标蛋白的检测。由于已知抗体数量的局限性，因此抗体相关蛋白检测方法无法像MS那样非靶标性地检测出样本中大量的蛋白。
7. 生物信息学（bioinformation）研究·生物信息学是蛋白质组学研究不可缺少的技术支持平台，今后的蛋白质鉴定几乎都必须依靠软件的分析来鉴定蛋白质。生物信息学是以计算机和计算机网络为工具，用数学和信息学的理论和方法对生物信息进行收集、整理、储存和分析的科学，它由数据库、计算机网络和应用软件组成。生物信息学在蛋白质组学研究中有两个重要应用：一是数据库的构建与搜索，二是分析双向电泳图谱。目前应用最普遍的数据库是NRDB和dbEST数据库。
二、 泪液蛋白质组学的研究进展及意义
1. 泪液成分的研究·Reitz等收集健康志愿者非刺激泪液，用自制的pH3～10固相pH梯度胶（immobilized pH gradients, IPG）进行一向等电聚集电泳，继而在SDS聚丙烯凝胶（SDS-PAGE）进行二维电泳，并分别用考马斯亮蓝染色。IPG密度测定曲线显示31个峰，代表胶条上的31条带。二维电泳得到了13个蛋白群。Molloy等取未戴接触镜的健康人泪液15 μl，进行IPG、SDS-PAGE，之后进行银染、氨基酸分析和N-末端测序。在SWISS-PROT查询，确认了6种蛋白质；对一未曾报道过的蛋白点进行了序列分析，发现其与人乳球蛋白（human mammaglobin）及鼠前列腺类固醇结合激素（rPSB）具有高度同源性，在24位上有相同的类固醇结合位点。实验者将此蛋白命名为泪液球蛋白（lacryglobin），并认为该蛋白的高表达可能与癌症有关。
由于临床上所获得的泪液量较少，导致泪液蛋白质组的研究面临挑战，Li等研究发现通过LC-MALDI-MS仅用2 μl的泪液发现了44种蛋白。Zhou认为LC/ESI-MS鉴定和分析泪液中的不同蛋白质组分快速、可重复和简单。重要的是，此技术在色谱上可实现每种组分的定量，特别适用于鉴定泪液中的小分子蛋白（＜80 000）。
根据目前的泪液蛋白质研究结果可将泪液蛋白分为4类：① 来自眼表主泪腺、睑板腺、杯状细胞、副泪腺分泌的蛋白，这类蛋白是泪液蛋白的主要组成部分，包括溶菌酶、乳铁蛋白、sIgA、脂质转载蛋白-1（也称泪液特异性前白蛋白，tear-specific prealbumin, LCN-1）、前列腺蛋白类脂肪酶、lacritin蛋白和富含脯氨酸蛋白质等。② 眼表细胞/组织释放蛋白，这类蛋白参与眼表功能的维护，是眼表细胞正常分泌或细胞死亡后分泌到泪液中的蛋白。③ 异常分泌的蛋白，这类蛋白来自病理状态下组织分泌的蛋白，因此可作为疾病的诊断标志物。④ 外来蛋白，这类蛋白并非眼部自身组织分泌，而是来自于外来生物，如传染性微生物分泌并释放到泪液中的代谢产物。根据泪液中蛋白含量不同，可将泪液蛋白分为3类，高含量的泪液蛋白、来自眼表组织或细胞或细胞代谢信号通路产生的中等含量蛋白或分子，以及低含量的细胞因子及生长因子等。泪液中这些丰富的蛋白质组并不是血浆蛋白质组的简单反映，其成分和质量浓度均存在明显差异，主要体现在泪液中的一些蛋白承担着防御病原微生物的功能。泪液也是眼部免疫系统的重要组成部分，如溶菌酶和乳铁蛋白均具有抗微生物活性。
2. 糖尿病·研究发现糖尿病患者干眼病患病率增高，其严重程度与糖尿病视网膜病变程度相关。为进一步了解糖尿病患者泪液蛋白与正常人的差异，Herber等收集了Ⅱ型糖尿病患者和健康对照者的基础分泌泪液各10例，依次进行IPG、垂直SDS-PAGE，荧光SYPRO Ruby染色后，用紫外光激发出荧光，照相后进行人工神经网络分析。结果发现，在糖尿病患者泪液的二维电泳图中有（243±31）个蛋白点，对照组仅（166±11）个点，差异具有统计学意义。
3. 干眼症·Grus等应用SDS-PAGE进行泪液蛋白电泳，然后将电泳结果扫描至电脑进行图像分析，发现干眼症患者和正常人的电泳条带特征明显不同，通过此方法诊断干眼症的正确率高达90%以上。Grus等利用高效液相色谱（HPLC）对糖尿病干眼患者、非糖尿病干眼患者和正常人进行泪液蛋白质的检测，结果发现三组之间差异具有显著性，干眼患者的sIgA峰显著小于正常对照组，HPLC测试和统计分析时间较电泳短，并可作为干眼的诊断性指标。
Kitagawa等运用SELDI蛋白质芯片技术对18例Sjögren综合征患者及24例对照组分析泪液标本，结果发现Sjögren综合征患者的泪液蛋白质有显著的改变。
Wirthlin等利用SELDI蛋白质芯片技术对干眼症患者和正常对照组的泪液采用三种不同的化学表面芯片：阳离子交换型（CM210）、疏水型（H50）及铜离子螯合型（IMAC）进行分析，发现主要的蛋白质峰（如溶菌酶、脂蛋白等）可被鉴别出来。平均每种芯片可探测到超过60种的蛋白质。经判别分析后发现干眼症组与对照组的泪液蛋白质图谱有着显著差别。而且能检测到小达2 000的蛋白质，这用以往的技术如电泳技术是无论如何也达不到的。应用生物标记物可把干眼症和对照组的泪液样本区别开来，并且重复性很高。
Grus等对88例干眼症及71例健康眼的泪液进行检测。每个样本分别采用了三种不同的化学表面芯片（CM10阳离子交换型、Q10阴离子交换型、H50反相交换型）和高低两种激光能量进行检测。重要的生物标记物则进一步被纯化，再用串联质谱进行鉴定。结果发现七个肽的多生物标记物组，结合人工神经网络进行分析判别，可用于干眼症的诊断，其特异性和敏感度均达到90%。对生物标记物的鉴定结果表明，干眼症患者泪液蛋白质的生物标记物中某些炎症因子增高（如钙粒蛋白A、α1抗胰蛋白酶的C端片段），而保护性因子（如PRP3、PRP4）则减少。并指出SELDI蛋白质芯片技术是对泪液蛋白质或肽进行大规模筛查的理想工具。可节省大量的时间，并可提供蛋白质或肽的准确的质量。
蛋白质组学作为一种新兴学科，已经开始蓬勃发展。研究泪液蛋白质组质和量的异常，将对明确眼表疾病病因、寻找新的药物治疗方法提供有效和可靠的途径。然而其中仍有许多问题有待解决，主要是蛋白质的分离、定量和功能的确定，尚待全世界科学家的共同努力，推进蛋白质组学的发展。