结膜松弛症与基质金属蛋白酶的研究
CCh是一种年龄相关性常见眼病，其发生与多种因素有关，发病机制并不十分明确。结膜松弛症患者球结膜组织弹力纤维减少，胶原纤维溶解，泪液中出现蛋白质及酶的异常表达，出现凋亡相关蛋白、炎性反应相关蛋白及防御素异常表达。有研究发现，CCh球结膜固有层成纤维细胞数量减少、外形呈长梭形、胞突细长、核-质比增大。
MMPs是水解ECM的蛋白裂解酶。包括基质中以及整合于质膜中的各种胶原酶和弹性蛋白酶等，是以ECM成分为水解底物的蛋白酶家系，主要在ECM的降解和重建中起作用。其活性依赖于锌离子和钙离子，其组织抑制剂TIMPs组成MMPs/TIMPs系统，降解和重塑细胞外基质。在生理条件下，MMPs和TIMPs之间保持动态平衡，以确保正常生理功能的进行，但在某些病理条件下，这种生理平衡状态被打破，从而对组织表现出极大的破坏力而致病。MMPs和TIMPs表达水平失衡与眼科疾病的发生发展密切相关。已发现这一酶系参与眼科多种疾病，如翼状胬肉、眼外伤、角膜病变、青光眼、糖尿病视网膜病变、增殖性玻璃体视网膜病变等。
基质金属蛋白酶（MMPs）有22种，在人眼分布最广泛的有MMP-1、MMP-2、MMP-3、MMP-9；MMPs可降解细胞外基质的几乎所有成分，在许多生理病理过程中发挥作用。MMPs有两种形式：MMPs前体蛋白（pro MMPs）和活化型MMPs（act MMPs）。MMPs可由多种类型细胞合成，包括成纤维细胞，并与抑制其活化的基质金属蛋白酶组织抑制剂（TIMPs）共同表达，MMPs与TIMPs的合成、分泌、活化之间微妙的平衡关系决定了ECM包括胶原纤维和弹性纤维的形成与降解；其中与结膜松弛症的研究联系较多的是MMP-1、MMP-3和MMP-9。MMP-1又名间质胶原酶，主要水解纤维类胶原（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ胶原）；MMP-3又称基质融解酶-1，可广泛融解酪蛋白、蛋白多糖、纤连蛋白、弹性蛋白等多种类型胶原蛋白；MMP-9具有明胶酶活性，主要的水解底物为变性胶原及IV、V型胶原蛋白。
相关的基础研究证实结膜松弛症结膜基质及Tenon囊的融解、变薄可能与MMPs，尤其是MMP-1、MMP-3、MMP-9在结膜组织和泪液中的表达量增多、酶活性增强有关。
一、 结膜松弛症球结膜组织基质金属蛋白酶表达的研究
李青松等采集结膜松弛症患者球结膜组织标本，对照组随机选择年龄匹配的单纯白内障超声乳化手术的病例，进行病例对照研究。对结膜松弛症球结膜组织中的MMP1、MMP-3、TIMP-1、TIMP-2、TIMP-3的表达进行检测。实验显示结膜松弛症球结膜组织中MMP-l表达量为（489.099±164.494）ng/ml，较正常对照组（304.167±218.750）ng/ml表达量高，差异有统计学意义。结膜松弛症球结膜组织MMP-3含量为（1 236.963± 1 419.531）ng/ml，较正常对照组含量（213.788±7.449）ng/ml高，差异有统计学意义。结膜松弛症球结膜组织TIMP-1含量为（1 529.923±2 147.487）ng/ml，较正常对照组含量（93.505±51.199）ng/ml高，差异有统计学意义。结膜松弛症球结膜组织TIMP-2含量（2 113.764±1 798.477）ng/ml，正常对照组含量为（289.855±121.969）ng/ml，差异无统计学意义。结膜松弛症球结膜组织组TIMP-3含量为（604.591±107.769）ng/ml，正常对照组含量为（548.000±154.091）ng/ml，P＝0.298，差异无统计学意义。
Ward等检测到松弛结膜组织上皮细胞及基质成纤维细胞MMP-3、MMP-9阳性细胞数均较正常组明显升高。Guo等在结膜松弛症成纤维细胞的裂解液及培养上清液中均检测到act MMP-1、act MMP-3，而正常组仅在细胞裂解液中检测到Pro MMP-1。
二、 基质金属蛋白酶及其组织抑制剂在结膜松弛症成纤维细胞中的表达
韩竹梅等对CCh球结膜成纤维细胞进行体外培养。由于CCh发病过程中球结膜成纤维细胞数量减少，其生长和适应能力均较差，原代培养过程中出现空泡现象，培养观察周期长，获得研究所需的人CCh球结膜成纤维细胞有一定难度。目前有关CCh球结膜成纤维细胞培养及鉴定的报道较少。韩竹梅等采用组织块贴壁原代培养方法，因为组织块培养法操作简单易培养成功。细胞成功培养首要条件是获得新鲜的、无菌的组织块。培养成功的关键是组织紧贴培养瓶或培养板的底部，细胞从组织周围溢出。在本实验中将组织块放于六孔板内放置培养箱内干燥，有利于组织块贴壁。细胞原代培养选择合适的培养基至关重要。上皮细胞和成纤维细胞是构成球结膜的两种主体细胞。通过两种细胞对胰酶的耐受性不同，采用差速贴壁法对细胞进行纯化。由于成纤维细胞对消化液比上皮细胞更敏感，实验中通过控制消化时间使成纤维细胞先脱壁，上皮细胞仍保存贴壁，经过两次传代后，培养出的细胞为成纤维样细胞。
目前国内外常用的三种细胞鉴定方法如下。
1. 细胞形态学观察·细胞形态一致，大小均一，呈放射状排列，为纤维样细胞。长梭形或两头尖的长条状，胞质中有一个或两个卵圆形的细胞核，这是成纤维细胞的形态学特征。
2. 免疫细胞化学染色法·采用细胞中间纤维免疫化学染色法，波形蛋白在组织病理学中作为最常用的间叶组织的标记，成纤维细胞中间丝的结构蛋白为波形蛋白，不同于上皮细胞的角蛋白，成为不同种类细胞分类鉴定的相对特异性标志，细胞免疫荧光显示波形蛋白表达阳性，角蛋白表达阴性。
3. 流式细胞术·波形蛋白表达阳性，角蛋白表达阳性极低，几乎不表达。因此采用组织块原代培养的CCh球结膜细胞通过胰酶的消化、差速贴壁法纯化，反复传代后采用以上方法的鉴定，获得成纤维细胞纯度较高，排除了上皮细胞的可能。为进一步实验提供了良好的细胞系。
李轶捷等利用CCh球结膜成纤维细胞培养的方法，采用的是含10%胎牛血清、0.1% FGS、100 μg/ml链霉素、100 U/ml青霉素的DMEM培养液。细胞原代生长较慢，经过传代后生长加快。
Meller等对CCh与正常结膜的成纤维细胞研究发现，CCh组结膜成纤维细胞MMP-1和MMP-3过度表达。Li等对正常结膜和CCh来源的结膜成纤维细胞进行培养研究，发现CCh患者成纤维细胞MMP-1和MMP-3蛋白表达在CCh中明显增加，分别为正常组的3.5～7.6倍及2.3～13倍。在CCh中，MMP-3的酶蛋白融解活性和MMP-1的胶原酶融解活性增强。这些研究结果提示MMPs与TIMPs的失衡导致了球结膜基质和Tenon囊的过度降解，继而发生CCh。
韩竹梅等采用ELISA法检测细胞培养上清液中基质金属蛋白酶的表达情况，采用CCh成纤维细胞的培养方法，选取3～6代呈对数生长的成纤维细胞，排除了原代培养中可能存在的上皮细胞。简单纯化了体外实验的研究环境，排除了细胞混杂因素的干扰，直接检测CCh成纤维细胞培养上清液中MMP-1、MMP-3、TIMP-1、TIMP-3的表达。研究显示CCh组成纤维细胞MMP-1、MMP-3呈高表达，TIMP-1的表达与两个对照组比较没有统计学意义，但TIMP-3的表达明显低于正常对照组。这些研究结果提示在CCh中MMP-1的表达水平明显升高，而TIMP-1并没有随之相应升高，同时，MMP-3的表达水平明显升高，而TIMP-3的表达却降低，上述球结膜成纤维细胞MMPs及TIMPs的病理表达可能参与了CCh的发生。
三、 基质金属蛋白酶及其组织抑制剂在结膜松弛症泪液中的表达
Acera等检测到结膜松弛症泪液中pro MMP-9含量明显高于正常组，且act MMP-9仅在结膜松弛症泪液中表达，提示结膜松弛症者MMPs表达上调，MMPs/TIMPs失衡，MMPs酶活性增强。
四、 杞精明目汤对结膜松弛症基质金属蛋白酶表达的影响
结膜松弛症的发病机制是MMP-1、MMP-3的过度表达导致MMPs与TIMPs的平衡失调，引起胶原纤维融解，弹力纤维的变性，导致球结膜基质和Tenon过度降解，球结膜变薄，筋膜萎缩，松弛的结膜堆积在下睑缘、内眦部和外眦部之间，形成皱褶，引起眼表泪液学的异常病理改变。
结膜松弛症在中医学上属于“白涩症”的范畴，肝肾阴虚与结膜松弛症的发生发展、预后及转归明显相关，其临床表现符合肝肾阴虚的辨证。临床研究已经证实，杞精明目汤在治疗肝肾阴虚型结膜松弛症方面有较好的疗效。
项敏泓等研究证实杞精明目汤药物血清可下调结膜松弛症球结膜成纤维细胞MMP-1、MMP-3、TIMP-1的表达，不同质量浓度药物血清组和EGF西药组较对照组结膜成纤维细胞中MMP-1、MMP-3和TIMP-1的表达均下调，含20%杞精明目汤药物血清的培养基可下调体外培养的人眼结膜松弛症球结膜成纤维细胞中MMP-1、MMP-3、TIMP-1的表达，显著上调TIMP-3的表达。