筛选具有重组DNA性状的受体生物个体——转化体

转化后，需要从众多的细胞中把真正接受了外源基因的细胞（转化体）筛选出来。在转化实验中，受体细胞是一个群体，但真正被转化的细胞仅仅是非常小的一部分，如何在庞大的群体中挑出转化体，是一个至关重要的问题。解决此问题的方法是，根据受体和给体所携带的标记，对接受转化处理的群体不断过筛和鉴定，犹如捕捉罪犯一样，先把嫌疑人列出，再逐步鉴别，最后验明正身。

首先，利用和选择培养基。转化用的受体大多为细胞群体，它们在人工条件下生存和繁殖的营养物质称为培养基。我们可根据转化用的DNA所携带的标记，选择不同的培养基。例如，我们把抗青霉素的DNA引入不抗青霉素的大肠杆菌（受体细胞群体）中，在这个群体中一个细菌就是一个细胞。其中一些大肠杆菌接受了抗性标记的DNA，就产生了对青霉素的抗药性，它们就是我们寻找的转化体。为筛选出这些转化体，便可采用含有青霉素的培养基。把转化处理后的细菌群体加在培养基中培养，真正的转化体由于有了抗药性而能够生长繁殖，其余的大肠杆菌则被抑制或杀死。挑出生长的大肠杆菌，即得到了转化体。

其次，利用细胞群落或菌斑。一个细胞可以在固体培养基表面不断分裂而形成细胞团，一般称为细胞群落，对细菌来说则称为菌落。如果我们所用的外源DNA载体是噬菌体，噬菌体可以进入细菌细胞中不断繁殖，最后可导致细菌细胞破裂，结果在培养基上形成大小不同的斑点，这就是噬菌斑，简称菌斑。菌斑则应含有外源DNA。如果不能肯定转化体内是否有外源DNA，此时就需借助细胞群落或菌斑杂交技术找出含有外源DNA的转化体，此法称为原位杂交。其要点是，把培养基上长出的菌落或菌斑转移到特殊的滤纸上，用碱处理，使细胞破裂，同时使DNA双链变为单链，而且固定其位置，然后用同位素标记好的一段已处理为单链的外源DNA（探针）浸泡固定着菌落或菌斑的滤纸，存在转化体的DNA单链就可以和外源DNA单链（探针）杂交，形成双链。待滤纸干燥后，在其上覆以X光胶片进行曝光，由于外源DNA有同位素标记，能使胶片感光，于是胶片上出现黑点，也就是说，若胶片上黑点的位置和培养基上菌落或菌斑位置一致的话，则菌落或菌斑即为可疑转化体。

最后是分子水平上的筛选与鉴定。上面所谈的筛选，实际上也是一种分子水平的筛选。但本节中强调的是用转化体DNA制品。在进行了前两项筛选以后，我们已经得到了一些初步认定的转化体，这样，我们就把可疑对象由成千上万缩小到便于操作的百十来个了，于是便有可能分离这些少数圈定对象的DNA，进入下一轮鉴定性筛选。常用的方法是分子杂交，又名Southern法（因英国科学家Southern首创得名）。此法的原理和基本步骤大体同原位杂交一样，只是须先提取转化体的DNA样品，并将它点样于一种叫作琼脂糖的凝胶的原点，然后在电场中予以分离（这种方法叫电泳，即分子在电场中泳动）；再将在凝胶上的DNA样品引至滤纸上，与作为探针的外源基因（或一部分）进行杂交，并根据X光胶片的感光黑线加以判断。如果可疑转化体DNA中包含了外源基因，那么它就能与作为探针的、由给体中抽提出来的外源基因杂交。因探针标记了同位素，所以能使X光胶片的对应部分感光而出现黑点。若如此，就说明这一可疑转化体是真正的转化体。读者也许会说，这同原位杂交没有什么区别，纯粹是多此一举。其实不然，因为前者有时会出现假阳性，是是非非，真伪难辨；前者的作用只是在缩小范围。科学研究结果的证实就是不断排除不肯定因素的过程，Southern法就是对原位杂交实验虚假现象的排除。当然，Southern法的结果还有其他意义，我们可根据杂交黑线的数目和深浅，推测外源基因在受体DNA中的数目（拷贝数）和插入位点的数目。

为了进一步确定外源基因在受体DNA中是否完整地插入，还须进行下一步筛选和鉴定，即检查外源基因在插入受体DNA后是否仍然保持原有的内切酶的切点。读者大概还会记得，在构建杂种DNA分子时，有一些因素可能造成内切酶切点的变化。例如将黏端变为平端，原先造成黏端的内切酶切点就不复存在，加入接头，就会引入接头具有的切点；再者，在外源基因引入受体时，也会由于受体系统的某些作用，使外源基因在插入受体DNA时失去原有切点，凡此都会引起内切酶切点的变化。现在，有一种转化技术叫内切酶介导整合，即在转化受体时，先用某种内切酶对DNA进行切割，然后再用切割后的DNA和这种内切酶一起对受体细胞进行转化，以期对受体细胞内的DNA造成同样的切口，便于DNA在此位点插入受体DNA。对于这种转化方法，检查内切酶切点尤为重要，给体DNA在受体DNA中内切酶切点的变化是常见现象。至于如何检查这种变化，读者可利用上面介绍的知识自己想出一些方法。