四、操作步骤
1.首先将内层锅取出，再向外层锅内加入适量的水，使水面与三角搁架相平为宜。
2.放回内层锅，并装入待灭菌物品。注意不要装得太挤，以免妨碍蒸汽流通而影响灭菌效果。三角烧瓶与试管口端均不要与桶壁接触，以免冷凝水淋湿包扎口的纸而透入棉塞。
3.加盖，将盖上的排气软管插入内层锅的排气槽内。再以两两对称的方式同时旋紧相对的两个螺栓，使螺栓松紧一致，勿使其漏气。
小提示
切勿忘记加水，同时加水量不可过少，以防灭菌锅烧干而引起炸裂事故。
4.用电炉或天然气加热，并同时打开排气阀，使水沸腾以排出锅内的冷空气。待冷空气完全排尽后，关上排气阈，让锅内的温度随蒸汽压力增加而逐渐上升。当锅内压力升到所需压力时，控制热源，维持压力至所需时间。本实验用0.1 MPa、121.5℃、20 min条件灭菌。
5.灭菌所需时间到，切断电源或关闭天然气，让灭菌锅内温度自然下降。当压力表的压力降至“0”时，打开排气阈，旋松螺栓，打开盖子，取出灭菌物品。
6.将取出的灭菌培养基放入37℃温箱培养24 h，经检查若无杂菌生长，即可待用。
小提示
灭菌主要因素是温度而不是压力。因此锅内冷空气必须全排尽后，才能关上排气阈，以维持所需压力。
小提示
压力一定要降至“0”时，才能打开排气阈，开盖取物，否则就会因锅内压力突然下降，使容器内的培养基由于内外压力不平衡而冲出烧瓶口或试管口，造成塞子沾染培养基而发生污染，甚至灼伤操作者。
思考与讨论
1.灭菌在微生物实验操作中有什么重要意义？
2.黑曲霉的孢子与芽孢杆菌的孢子对热的抗性哪个更强？为什么？
学无止境
消毒（disinfection）与灭菌（sterilization）两者的意义有所不同。消毒一般是指消灭病原菌和有害微生物的营养体，而灭菌则是指杀灭一切微生物的营养体、芽孢和孢子。微生物实验中，需要进行纯培养，不能有任何杂菌污染，因此对所用器材、培养基和工作场所都要进行严格的消毒和灭菌。消毒与灭菌的方法很多，一般可分为加热、过滤、照射和使用化学药品等。