四、操作步骤

四、操作步骤

第一步：梯度平板稀释法分离乳酸菌

用一支1 mL无菌吸管从酸奶中吸取1 mL乳酸菌液加入盛有9 mL无菌水的大试管中充分混匀，然后用无菌吸管从此试管中吸取1 mL，加入另一盛有9 mL无菌水的试管中，混合均匀，以此类推制成101、102、103、104、105、106不同稀释倍数的乳酸菌溶液（见图3-2）。

图3-2　从酸奶中分离乳酸菌稀释过程

第二步：平板涂布培养乳酸菌

将上述灭好菌的培养基的三组平板底部分别用记号笔写上104、105和106三种稀释度，然后用无菌吸管分别由104、105和106三管乳酸菌稀释液中各吸取0.1 mL对号滴入已写好稀释度的平板中央位置。用无菌涂布器涂布的时候，右手拿无菌涂棒平放在平板培养基表面上，将菌悬液先沿一条直线轻轻地来回推动，使之分布均匀，然后改变方向沿另一垂直线来回推动，平板内边缘处可改变方向用涂棒再涂布几次（见图3-3）。接种后放置于37℃培养箱中培养48 h。

图3-3　平板涂布操作步骤

第三步：观察乳酸菌

1.恒温培养48 h后，取出平板；选择菌落分布较好的平板先对其菌落形态（如菌落大小、表面状况、透明度、色泽、边缘、隆起度、透光性、是否分泌色素等特点）进行观察，初步找出乳酸菌菌落。乳酸菌菌落很小，大约1～3 mm，圆形隆起，表面光滑或稍粗糙，呈乳白色、灰白色或暖黄色。

2.乳酸菌形态观察（革兰氏染色法）

（1）涂片　取干净载玻片一块，在载玻片中央滴加一滴蒸馏水，将培养的乳酸菌做涂片，干燥、固定。

（2）染色　初染→媒染→脱色→复染→镜检