实训2　细菌标本片的制备与染色

实训2　细菌标本片的制备与染色

一、目的要求

能利用不同的材料进行细菌标本片的制备，学会细菌的常规染色。

二、仪器及材料

酒精灯、接种环、载玻片、盖玻片、染色缸、染色架、吸水纸、洗瓶、显微镜、香柏油、乙醇乙醚、擦镜纸、液体病料、固体病料、生理盐水、美蓝染色液、革兰氏染色液、瑞氏染色液。

三、方法与步骤

1.细菌标本的制备

（1）液体培养物及液体病料。

①涂片。用接种环取1 滴液体病料，于载玻片的中央均匀地涂布成适当大小的薄层。

②干燥。一般采用自然干燥，天气较冷时也可于酒精灯火焰上方30～40 cm 处适当加热干燥。

③固定。分为火焰固定和化学固定两种。火焰固定时，将干燥好的载玻片涂面朝上，以其背面在酒精灯火焰上来回通过数次，略作加热，以不烫手背为度。化学固定时，可将干燥好的载玻片浸入甲醇中2～3 min 后取出晾干，或在涂片上滴加数滴甲醇使其作用2～3 min后自然挥发干燥。此外，丙酮和酒精也可用作化学固定剂。作瑞氏染色的涂片不需固定，因染色液中含有甲醇，有固定作用。

④染色。根据不同的材料和菌种选择不同的染色法。

（2）固体培养物。用接种环取微量生理盐水于载玻片的中央，用接种环挑取1 个菌落于生理盐水中混合，均匀地涂布成适当大小的薄层，干燥，固定，染色。

2.细菌触片的制备

将固体病料（病变组织）作无菌切开，用切面在载玻片中央接触一下或稍用力印压成一薄层，干燥，固定，染色。

3.细菌的染色法

（1）美蓝染色法。在已干燥、固定好的涂片或触片上滴加适量的美蓝染色液，染色1～2 min后，水洗，干燥（吸水纸吸干或自然干燥），镜检。菌体呈蓝色。

（2）革兰氏染色法。

①在已干燥、固定好的涂片上滴加适量的草酸铵结晶紫染色液，染色1～2 min 后，水洗。

②加革兰氏碘液媒染，1～2 min 后，水洗。

③加95%酒精脱色，0.5～1 min 后，水洗。

④稀释石炭酸复红（或沙黄、番红）染色液复染，0.5 min 后，水洗，干燥，镜检。

结果：革兰氏阳性菌呈蓝紫色，革兰氏阴性菌呈红色。

（3）瑞氏染色法。在已干燥的涂片或触片上滴加瑞氏染色液，1～3 min 后再加与染液等量的中性蒸馏水或磷酸盐缓冲液，轻轻晃动载玻片使之与染色液混合均匀，再经3～5 min后，水洗，吸干或烘干后镜检。菌体呈蓝色，组织细胞的细胞质呈红色，细胞核呈蓝色。

（4）姬姆萨染色法。先将姬姆萨染色液原液稀释成常用的姬姆萨染色液（取5～10 滴原液于5 mL 新煮过的中性蒸馏水中，混合均匀）。在经甲醇固定好的涂片上滴加足量的染色液，或将涂片浸入盛有染色液的染色缸中，染色30 min 或浸染数小时至24 h 后取出，水洗，吸干或烘干后镜检。细菌呈蓝青色，组织细胞质呈红色，细胞核呈蓝色。

四、注意事项

（1）做细菌涂片时，不宜涂得过厚，以免影响制片效果。

（2）固定必须确实，火焰固定时温度不宜过高，以免破坏菌体结构。

（3）每种染液染色时，应保持染液不干，以免蒸发干，影响染色效果。

（4）每种染液染色后，必须用水将染液一起冲掉，不可先将染液倾去后再用水冲洗。