实训5 细菌的分离培养
一、目的要求
掌握细菌的分离培养、纯化的方法，观察细菌的培养特性。
二、仪器及材料
恒温培养箱、病料或细菌培养物、接种环、接种针、酒精灯、各种细菌培养基等。
三、方法与步骤
1.细菌的分离培养
（1）病料的采取。将新鲜肛门拭子用灭菌生理盐水洗涤，洗涤液可用于分离培养；无菌采取新鲜粪便的中心部分，用灭菌生理盐水稀释搅匀后澄清，其上清液可用于分离培养；如为病理组织，可用烧红的刀片在其表面烫一下，随即用此刀片在烫过的地方切开一小口，用灭菌接种环在切口内蘸一下即可用于分离培养。
（2）平板划线分离培养。目的是将病理材料中的细菌分散，以便使细菌单在，从而发育成单个菌落，防止长成菌苔。
①直接划线分离培养。点燃酒精灯后，左手持培养皿，底朝下，盖在上，以无名指和小指托底，拇指、食指和中指将皿盖揭开成20°，角度不宜过大，以防空气进入；右手持接种环，在火焰上烧灼后取少许的材料涂在培养基边缘，将接种环上多余的材料在火焰上烧掉，然后在培养基表面进行“Z”字形划线，然后将平皿盖好，倒置于恒温培养箱中培养（图1.20）。
②分区划线分离培养。用记号笔在培养皿底外部划线，将培养基分成3～6 个小区，持皿方法同直接划线，但每划完一个小区应将平皿旋转一定角度，以便于划线（图1.21）。
图1.20 平板划线操作示意图
图1.21 划线分区示意图
③斜面划线分离培养。左手持试管，手掌朝上，食指和拇指夹住试管；右手持接种环，先将试管的棉塞端在酒精灯火焰上方旋转两周，然后用右手小指和手掌边缘夹住棉塞，打开试管，保持试管口在火焰上方进行操作，在斜面上从试管底部向试管口作“Z”字形划线，接种完毕，在酒精灯火焰附近塞上棉塞后，在火焰上方旋转两周。用试管架直立放置于恒温培养箱中培养。
④增菌培养。当病料中的细菌很少时，直接进行分离培养往往不易成功，常先用液体培养基进行增菌培养。方法是取少许病理材料直接加入培养基中，置恒温培养箱中培养24～48 h 后，可取少量培养液作划线分离培养。
2.细菌的纯化
操作方法基本同分离培养，但进行斜面纯化移植时左手应同时握住原培养管和待接种管，右手小指和手掌边缘夹住一个棉塞，无名指和中指夹住一个棉塞，必要时中指和食指还可夹住第三个棉塞，液体培养基的纯化移植同液体培养基初次分离培养。
3.细菌在培养基上的生长特性观察
（1）固体培养基上的生长特性。细菌在固体培养基上生长繁殖，可形成菌落。观察菌落时，主要看以下内容：
①大小。不同细菌，其菌落大小变化很大。常用其直径来表示，单位是mm 或μm。
②形状。主要有圆形、露滴状、乳头状或油煎蛋状、云雾状、放射状或蛛网状、同心圆状、扁平状和针尖状等。
③边缘特征。有整齐、波浪状、锯齿状、卷发状等。
④表面性状。有光滑、粗糙、皱褶、颗粒状、同心圆状、放射状等。
⑤湿润度。有干燥和湿润两种。
⑥隆起度。有隆起、轻度隆起、中央隆起和云雾状等。
⑦色泽和透明度。色泽有白、乳白、黄、橙、红及无色等；透明度有透明、半透明、不透明等。
⑧质地。有坚硬、柔软和黏稠等。
⑨溶血性。分为α-溶血、β-溶血和γ-溶血3 种。
（2）液体培养基上的生长特性。
①浑浊度。有强度浑浊、轻微浑浊和透明3 种。
②底层情况。包括有沉淀和无沉淀两种，有沉淀又可分为颗粒状和絮状两种。
③表面性状。分为形成荚膜、菌环和无变化3 种情况。
④产生气体和气味。很多细菌在生长繁殖的过程中能分解一些有机物产生气体，可通过观察是否产生气泡或收集产生的气体来判断；另一些细菌在发酵有机物时能产生特殊气味，如鱼腥味、醇香味等。
⑤色泽。细菌在生长繁殖的过程中能使培养基变色，如绿色、红色、黑色等。
（3）半固体培养基上的生长特性。有运动性的细菌会沿穿刺线向周围扩散生长，形成侧松树状、试管刷状；无运动性的细菌则只沿穿刺线呈线状生长。
四、注意事项
（1）细菌的分离培养必须严格无菌操作。
（2）接种环或接种针在挑取菌落之前应先在培养基上无菌落处冷却，否则会将所挑的菌落烫死而使培养失败。
（3）划线接种时应先将接种环的环部稍弯曲，同时用力适度；分区接种时，每区开始的第一条线应通过上一区的划线。
（4）不同细菌所需要的培养时间相差很大，应根据不同的菌种培养观察足够的时间。