实训7 理化因素对微生物的影响
一、目的要求
（1）了解温度、紫外线、pH 值及化学药剂对微生物的影响。
（2）掌握无菌操作技术及培养基的制备。
二、基本原理
微生物的生命活动与周围环境有密切的联系，适宜的环境能够促进微生物的生长、繁殖。不适宜的环境则使微生物的生长受到抑制，甚至死亡。影响微生物生长的环境因素有很多，本实验着重讨论温度、紫外线、pH 值及化学药剂对微生物的影响。
1.温度对微生物的影响
温度通过影响蛋白质、核酸等生物大分子的结构与功能以及细胞结构，如细胞膜的流动性、完整性来影响微生物的生长繁殖和新陈代谢。过高的环境温度会导致蛋白质或核酸的变性失活，而过低的温度会使酶活力受到抑制，细胞的新陈代谢活动减弱。每种微生物只能在一定的温度范围内生长，低温微生物最高生长温度不超过20 ℃，中温微生物的最高生长温度不超过45 ℃，而高温微生物能在45 ℃以上的条件下正常生长。某些极端高温微生物甚至能在100 ℃以上的条件下生长。
2.紫外线对微生物的影响
紫外线波长为200～300 nm 的部分具有杀菌作用，其中以265～266 nm 的杀菌力最强。紫外线的杀菌原理是细菌经紫外线照射后，同一条DNA 链上相近的胸腺嘧啶之间形成二聚体，改变DNA 的分子构型，影响DNA 复制与转录时的正常碱基配对，引起致死性突变而死亡。此外，紫外线还可使空气中的分子氧变为臭氧，臭氧放出氧化能力强的原子氧，也具有杀菌作用。
3.pH 值对微生物的影响
一是使蛋白质、核酸等大分子所带电荷发生改变，从而影响其生物活性；二是引起细胞膜电荷变化，导致微生物细胞吸收营养物质能力改变；三是改变环境中营养物质的可溶性及有害物质的毒性。不同微生物对pH 值条件的要求各不相同，它们只能在一定的pH 值范围内生长，这个pH 值范围有宽有窄，而其生长最适pH 值常限于一个较窄的范围，对pH 值条件的不同要求在一定程度上反映出微生物对环境的适应能力。
4.化学因素对微生物的影响
常用化学消毒剂主要有重金属盐类、酚、醇、醛等有机化合物以及燃料和表面活性剂等。其杀菌或抑菌作用主要是使菌体蛋白质变性。
三、仪器及材料
（1）菌种：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、酵母菌。
（2）培养基：牛肉膏蛋白胨液体培养基、牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、马铃薯葡萄糖培养基。
（3）溶液及试剂：0.1%新吉尔灭、0.1%龙胆紫、2.5%碘液、0.85%生理盐水。
（4）仪器或其他用具：恒温培养箱、4 ℃冰箱、水浴锅、10 mL 无菌带帽试管、培养皿、接种环、无菌吸管、玻璃涂布棒、紫外灯箱、黑纸、标签纸、镊子、200 μL 移液器、1 000 μL 移液器、灭菌枪头、记号笔等。
四、方法与步骤
1.温度对微生物的影响
（1）将培养24～48 h 的大肠杆菌斜面和酵母菌斜面加入无菌生理盐水5 mL，用接种环刮下菌苔制成菌悬液。
（2）取预先配置好的牛肉膏蛋白胨液体培养基和马铃薯葡萄糖培养基试管各8 支（每支5 mL 培养基），分别标为A 组、B 组。A 组接入大肠杆菌悬液0.1 mL，混匀；B 组接入酵母菌悬液0.1 mL，混匀。分别在4 ℃、25 ℃、37 ℃、50 ℃条件下培养，每个温度设置两个重复。
（3）在相应温度下培养24 h 后记录结果，根据菌液的浑浊度判断大肠杆菌和酵母菌生长繁殖的最适宜温度。
2.紫外线杀菌效果观察
（1）制备牛肉膏蛋白胨琼脂平板1 个（每皿15～20 mL）。
（2）用灭菌滴管吸取大肠杆菌悬液3～4 滴于上述普通琼脂平板表面，用玻璃涂布棒将菌液涂布均匀。
（3）打开培养皿盖，用无菌黑纸遮盖部分平板，置于预热10～15 min 的紫外灯下，紫外线照射30 min，弃去黑纸，盖上皿盖。倒置于37 ℃恒温箱中培养18～24 h 后，观察细菌分布情况。
3.pH 值对微生物生长的影响
（1）配置牛肉膏蛋白胨液体培养基10 支。分别调pH 值至3、5、7、9 和11，每个pH 值设定两个重复，每管盛培养液5 mL，灭菌备用。
（2）分别吸取前期制备的大肠杆菌悬液0.1 mL，接种于装有不同pH 值的牛肉膏蛋白胨液体培养基的试管中，于37 ℃培养箱中培养24～48 h。
（3）将上述试管取出，根据菌液的浑浊度或利用722 型分光光度计判定大肠杆菌最适生长的pH 值。
4.化学药剂对微生物的影响
（1）将培养24 h 的大肠杆菌斜面和金黄色葡萄球菌斜面加入无菌生理盐水5 mL，用接种环刮下菌苔制成菌悬液。
（2）将已灭菌并冷却至45 ℃左右的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基（15～20 mL）倒入无菌平皿中（每种试验菌一皿），凝固后，用移液器分别吸取金黄色葡萄球菌和大肠杆菌悬液0.1 mL于上述普通琼脂平板表面，用玻璃涂布棒将菌液涂布均匀。
（3）将平皿底划分成4 等份，每一等份内标明一种消毒剂的名称，采用无菌操作技术，用无菌眼科镊子将已灭菌的小圆滤纸分别浸入装有0.1%新吉尔灭、0.1%龙胆紫、2.5%碘液的小玻璃平皿中浸湿。然后取出滤纸片，在试管内壁沥去多余药液，尽量保证滤纸片所含消毒剂容易量基本一致，将滤纸片贴在平板相应区域，以浸有无菌生理盐水的滤纸片作为对照。
（4）将上述贴好滤纸片的平板放于37 ℃培养箱中，倒置培养24 h，取出观察抑菌圈的大小，并对比大肠杆菌和金黄色葡萄球菌对各种消毒剂的耐受力。
五、实验结果
（1）观察大肠杆菌和酵母菌在不同温度下培养的菌液浓度，找出大肠杆菌和酵母菌生长的最适温度。
（2）取出经紫外灯照射的平皿，观察细菌的分布状况，分析紫外线对平板上细菌生长状况的影响。
（3）观察记录不同pH 值条件下大肠杆菌的生长情况，找出大肠杆菌生长的最适pH 值。
（4）取出培养皿，观察抑菌圈，并记录抑菌圈的直径。分析各类化学试剂对微生物的抑菌（杀菌）效果。
六、注意事项
（1）注意吸取菌悬液时要将菌液吹打均匀，保证各管接入的菌液浓度一致。
（2）实验过程中采用无菌操作技术，避免其他因素对结果的干扰。