实训6 细菌的生物化学试验
一、目的要求
通过本试验加深对细菌生化反应原理和意义的理解，掌握常规细菌生化试验操作方法。
二、仪器及材料
各种微量发酵管、 蛋白胨水溶液、葡萄糖蛋白胨水溶液、对位二氨基苯甲醛、无水乙醇、戊醇（或异戊醇）、乙醚、浓盐酸、甲基红、蒸馏水、菌种。
三、方法与步骤
1.糖类发酵（分解）试验
原理：细菌含有分解不同糖（醇、苷）类的酶，因而分解各种糖（醇、苷）类的能力也不一样。有些细菌分解某些糖（醇、苷）产酸（符号： +）、产气（符号：○），培养基由蓝变黄（指示剂溴麝香草酚蓝由蓝遇酸变黄的结果），并有气泡；有些产酸，仅培养基变黄；有些不分解糖类（符号：-），培养基仍为蓝色。
试验时，将细菌无菌操作接种于糖发酵培养基中，于37 ℃培养24～48 h 观察，结果有3种：
有的只产酸（ +），有的产气产酸（⊕），有的不发酵（ -）。
2.VP 试验（二乙酰试验）
原理：某些细菌能分解葡萄糖，分解过程为葡萄糖→丙酮酸→乙酰甲基甲醇→2， 3-丁烯二醇，在有碱存在时氧化成二乙酰，二乙酰和胨中的胍基化合物起作用，产生粉红色的化合物。
试验时，将被检细菌接种于0.5%葡萄糖蛋白胨培养基，于35～37 ℃培养48 h，于2 mL培养物中加入甲液1 mL 和乙液0.4 mL，摇振混合。
试验时，强阳性者约于5 min 后，可产生粉红色反应（长时间无反应，置室温过夜），次日不变者为阴性。
3.甲基红（MR）试验
原理：某些细菌在糖代谢过程中生成丙酮酸，有的甚至进一步被分解为甲酸、乙酸、乳酸等，而不是生成VP 试验中的二乙酰，从而使培养基的pH 值下降至4.5 或以下（VP 试验的培养物pH 值常在4.5 以上），故加入甲基红试剂呈红色。
试验时，接种细菌于培养液中，37 ℃培养4 天后，于培养物中加入几滴试剂，变红色者为阳性反应。
4.枸橼酸盐利用试验
原理：当细菌利用铵盐作为唯一氮源，并利用枸橼酸盐作为唯一碳源时，可在枸橼酸盐培养基上生长，生成碳酸钠，并同时利用铵盐生成氢，使培养基呈碱性。
试验时，取菌接种于柠檬酸盐琼脂培养基斜面上，于37 ℃培养4 天，培养基变为蓝色，则为阳性，否则为阴性。
5.吲哚试验
原理：细菌分解蛋白胨中的色氨酸，生成吲哚（靛基质），经与试剂中的对位二甲基氨基苯甲醛作用，生成玫瑰吲哚。
试验时，取细菌接种于蛋白胨水培养基中，37 ℃培养2～3 天，沿着试管壁加入吲哚试剂2 mL，如能形成玫瑰吲哚，则为阳性反应，不变色为阴性反应。
6.硫化氢试验
原理：有些细菌能分解含硫氨基酸，产生硫化氢（H2S），H2S 会使培养基中的醋酸铅或氯化铁形成黑色的硫化铅或硫化铁。
试验时，用接种针取细菌穿刺与含有醋酸铅或硫酸亚铁的琼脂培养基中，37 ℃培养4天，凡沿穿刺线或穿刺线周围变为黑色者为阳性，不变色者为阴性。