实训14 E-玫瑰花环试验
一、基本原理
玫瑰花环试验是体外检测人和动物细胞免疫功能的一种方法。E-玫瑰花环试验是T 淋巴细胞计数的一种重要方法。由于人和动物的T 淋巴细胞表面有红细胞受体，因此红细胞可以黏附到T 淋巴细胞的周围而形成玫瑰花样的细胞团。在红细胞中，以绵羊红细胞最为常用。B 淋巴细胞没有红细胞受体，所以不能形成E-玫瑰花环，以资鉴别。
二、仪器材料
（1）肝素抗凝剂。
（2）淋巴细胞分层液：配制方法见细胞分离技术。用5.6%NaHCO3 调pH 值至7.2，115 ℃15 min 灭菌。4 ℃储藏备用。
（3）5.6%NaHCO3 液：NaHCO3 5.6 g，H2O 100 mL，115 ℃20 min 灭菌，4 ℃储藏备用。
（4）0.8%戊二醛溶液：25%戊二醛溶液，0.32 mL Hank’s 液，9.68 mL 用前配制。
（5）Giemsa-weight 染色液：Giemsa 粉0.03 g，Weight 粉0.3 g，甲醇100 mL。
先将染料一起放入研钵内，加入少量甲醇，研磨细，然后倒入瓶内，并用甲醇冲洗研钵内染料，一起倒入玻瓶内，补足甲醇量，备用。
三、方法与步骤
（1）取肝素抗凝血2 mL，置37 ℃水浴自然沉淀30～40 min，吸取全部血浆（约1 mL）。
（2）于血浆中加Hank’s 液数毫升，洗涤，1 500 r/min 离心5～10 min，弃上清液。重复洗涤4 次，沉淀均匀即为淋巴细胞悬液。
（3）采绵羊肝素抗凝血，加数倍Hank’s 液，洗涤3 次，最后以Hank’s 配成10%悬液，4 ℃保存。
（4）取0.1 mL 淋巴细胞悬液，加10%红细胞悬液0.1 mL，加小牛血清0.1 mL。
（5）37 ℃水浴10 min 600 r/min，低速离心5 min。
（6）吸弃多余的上清液后，放入4 ℃冰箱2～4 h。
（7）取出后，将沉淀轻轻摇起，加0.8%戊二醛0.1 mL，混匀后4 ℃固定15 min。
（8）将干净的玻片用Hank’s 液沾湿，滴一小滴混悬液，让其自然散开即可。
（9）自然干燥后，用吉姆萨-瑞氏液或苏木精-伊红染色，水洗，干燥镜检。
四、实验结果
凡1 个淋巴细胞结合3 个或3 个以上的红细胞者为1 个E-玫瑰花环。检查200 个淋巴细胞，按相应公式计算其玫瑰花环形成率。
某些动物E-玫瑰花环率
五、注意事项
（1）影响E-玫瑰花环试验最主要的因素是淋巴细胞和红细胞的新鲜程度，被检血样必须新鲜、无菌，采血后要求在3～4 h 内进行检验，否则由于淋巴细胞的死亡，受体脱落，影响检查结果。红细胞用阿氏液保存最多不要超过3 周，且不应溶血。
（2）反应温度、时间等条件的控制对玫瑰花环形成率有较大影响。选37 ℃作用10 min，低速离心5 min，置4 ℃2～4 h，其结果稳定性较好，结合率较高。如在37 ℃作用时间较长，可见玫瑰花环发生变形，结合部位松弛、拉开，甚至解离。
（3）指示红细胞的动物种类也与玫瑰花环的形成率有关。如马淋巴细胞与豚鼠红细胞结合较好，而驴淋巴细胞则与绵羊红细胞结合较好。Melinda 氏报道，人、马、牛、猪、狗、猫、鼠与豚鼠红细胞的结合率都高于绵羊红细胞的结合率。
（4）加犊牛血清能增加玫瑰花环形成细胞的稳定性，增强与指示红细胞结合的牢固性。
（5）Hank’s 液的pH 值以7.2～7.4 为宜。