实训15　T 淋巴细胞转化试验

实训15　T 淋巴细胞转化试验

一、原理

T 淋巴细胞在有丝分裂原植物血凝素（PHA）等刺激后，细胞的形态和代谢发生变化，发生一系列增殖反应，如出现细胞体积增大、核染色质疏松、蛋白质和核酸合成增加，并转化为淋巴母细胞。T 淋巴细胞转化试验有形态学计数法、MTT 法、同位素法等，这里主要运用形态学计数法。

二、仪器及材料

RPMI 1640 培养液（小牛血清10%、青霉素100 μg/mL、链霉素100 μg/mL，用无菌的3% NaHCO3 调pH 值至7.2～7.4）、PHA（用含10%小牛血清的RPMI 1640 培养液稀释至500～1 000 g/mL）、肝素抗凝血、姬姆萨染液、细胞培养瓶、CO2 培养箱、超净台、高压灭菌器；无菌过滤装置、离心机、显微镜等。

三、方法与步骤

（1）取肝素抗凝血0.2 mL，注入预先加有1.8 mL RPMI 1640 培养液的培养瓶内，同时加入PHA（500 g/mL）0.1 mL，对照瓶内不加PHA。混匀后置37 ℃、5% CO2 培养箱内孵育72 h，其间每天旋转摇匀一次。

（2）培养结束后，弃去上清液，混匀细胞，加入离心管中，1 500 rpm 离心10 min。

（3）弃上清液，吸取白细胞层制片，自然干燥。

（4）甲醇固定1～2 min 后，吉姆萨染色15～20 min，水洗，干燥。

（5）油镜下计数200 个淋巴细胞，观察淋巴细胞的形态变化，计算淋巴细胞转化率。

四、结果判定

（一）形态

1.成熟的小淋巴细胞

与未经培养的小淋巴细胞一样，直径为6～8 μm，核染色致密，无核仁，核与胞浆比例大，胞浆染色为轻度嗜碱性。

2.淋巴母细胞

细胞体积增大，直径为20～30 μm ，形态不整齐，常有小突出，核质染色疏松，有核仁1～2个，胞浆变宽，常出现胞浆空泡。

3.过渡型淋巴细胞

比小淋巴细胞大，直径为10～20 μm，核染色致密，但出现核仁，此为与成熟小淋巴细胞鉴别要点。

4.其他细胞

如中性粒细胞在培养72 h 后，绝大部分衰变或死亡，呈碎片。

（二）淋巴细胞转化率

按上述分类检查推片头、体、尾三部分，分别计数淋巴母细胞、过渡型母细胞和核有丝分裂相细胞以及成熟的小淋巴细胞，以前三者为转化细胞，每份标本计数200 个细胞，按下列公式计算转化率：

在正常情况下，PHA 诱导的淋巴细胞转化率为60%～80%，如为50%～60%则偏低，50%以下则为降低。

五、注意事项

（1）培养基成分对转化率影响较大，注意其有效期。

（2）小牛血清用前需灭活。

（3）培养时要保证有足够的气体，保证无菌。

（4）PHA 剂量过大对细胞有毒性，PHA 转化反应剂量一般10 mL，培养瓶内液体总量不要超过2 mL，太小不足以刺激淋巴细胞转化，试验前应先测定。